一种包涵体蛋白的复性方法及用途技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种包涵体蛋白的复性方法及用途。一种包涵体蛋白的复性方法，包括：将包涵体蛋白溶于NTA Buffer溶液中，超声促进杂蛋白的溶解；用6 M的盐酸胍溶液溶解包涵体蛋白，将溶解的包涵体蛋白用3M的盐酸胍进行2倍体积稀释，逐滴滴入复性液进行复性48 h；利用PEG 20000将复性后的液体进行100倍浓缩即可得到可溶性蛋白。本发明专利技术采用蛋白复性的方法将表达量较高的包涵体蛋白进行纯化、溶解和复性，得到纯度较高的可溶性蛋白，能保证抗原的有效性。能保证抗原的有效性。能保证抗原的有效性。

【技术实现步骤摘要】
一种包涵体蛋白的复性方法及用途


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种包涵体蛋白的复性方法及用途。

技术介绍

[0002]原核表达的方法简单，成本低廉且表达量高，表达的蛋白经复性后可直接作为抗原在实验中运用，但表达的蛋白大部分以不溶的包涵体的形式存在。因此，包涵体的溶解和蛋白的复性成为制备有效抗原的关键部分。
[0003]包涵体蛋白的复性通常有稀释、透析、色谱复性等几种方法。透析法通过逐渐降低外透液浓度控制变性剂去除速度，达到包涵体复性的目的，具有操作简单的，不增加体积的优点。透析复性时，蛋白在折叠过程中，分子内的疏水基团暴露在溶液中，多肽链的疏水基团之间相互作用、碰撞，可能形成不正确的折叠而导致聚集。因此，蛋白质复性是蛋白折叠和聚集的平衡，温度升高，则疏水作用力增强，蛋白质折叠速度增加，但会使得二硫键更易错配，更容易发生蛋白聚集，进而大大降低复性蛋白的活性及复性回收率，故透析复性温度一般选择在较低的温度中进行，例如2℃至28℃的温度，尤其是2℃至8℃的低温环境，而对于高于30℃的高温，传统包涵体蛋白的透析复性方法是尽量避免的。
[0004]此外，包涵体中包含重组蛋白，以及不同程度的来自宿主菌的蛋白、核酸以及细胞膜等杂质成分。通常认为，这些杂质在复性过程中，容易引起蛋白聚集，导致产率降低。因此，为了减少由这些杂质引起的蛋白聚集，也使得复性通常需要在低温下进行。
[0005]蛋白质复性是一个非常复杂的过程，其方法很大程度上与该蛋白质本身的特性有关系。分泌型蛋白、可溶性蛋白、包涵体蛋白的复性方法有巨大的差异。就包涵体蛋白而言，不同的包涵体蛋白的疏水性有所差异。采用传统的包涵体低温透析复性方法，能够实现疏水性较低、亲水性较好的蛋白的较高复性效率，比如巨细胞病毒抗原蛋白、疱疹病毒抗原蛋白、猪瘟病毒抗原蛋白、结核分枝杆菌抗原蛋白。但在一些抗原蛋白，如弓形虫、风疹病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、柯萨奇病毒、梅毒螺旋体、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒等的疏水性相对较强的抗原蛋白的透析复性中，包涵体低温透析复性的效果不理想，低温透析复性得到的产物中掺杂有大类非目标蛋白，导致产物纯度低，活性差，稳定性也不好，放置后产物常常再次聚集，产生沉淀。
[0006]考虑到目前对蛋白质体外折叠聚集平衡机制的不完全理解，为特定的包涵体蛋白寻找合适的复性方法往往并不容易。因此，本领域仍需要对特定蛋白的复性方法进一步探索。

技术实现思路

[0007]本专利技术解决的技术问题是重组蛋白的溶解性问题，即将原核表达后的不溶的包涵体变成可溶性的蛋白。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术本专利技术提供了一种包涵体蛋白的复性方法，包括：将包涵体蛋白溶于NTA Buffer溶液中，超声促进杂蛋白的溶解；
用6 M的盐酸胍溶液溶解包涵体蛋白，将溶解的包涵体蛋白用3M的盐酸胍进行2倍体积稀释，逐滴滴入复性液中复性48 h；利用PEG 20000将复性后的液体进行100倍浓缩即可得到可溶性蛋白。
[0009]优选地，所述的复性液为：每升中含氧化型谷胱甘肽0.308 g，还原型谷胱甘肽1.54 g，EDTA2Na0.744 g，精氨酸69.68 g，TRIS 12.12 g，去离子水；溶液pH为8.0。
[0010]优选地，所述6 M盐酸胍溶液中含有终浓度为5 mM的DTT。
[0011]本专利技术还提供了上述包涵体蛋白的复性方法的用途，该方法在抗体检测中，用于对抗原重组蛋白包涵体进行复性。
[0012]本专利技术还进一步提供一种抗体的检测方法，其中抗原为原核表达的重组蛋白，包括以下步骤：1.利用重组质粒在大肠杆菌 BL21感受态细胞中进行诱导表达，得到含目的蛋白的大肠杆菌；2. 将大肠杆菌进行超声破碎后，离心，电泳确认包涵体蛋白；3.将包涵体蛋白溶于NTA Buffer溶液中，超声促进杂蛋白的溶解；4.对包涵体蛋白进行溶解及复性，得到可溶性蛋白；5.将0.05 M的碳酸盐溶液和稀释不同浓度的抗原蛋白进行1:1比例混匀，置于ELISA空白板，37℃孵育1 h后PBS溶液清洗，加入5%的脱脂奶粉溶液300 μL，继续孵育1 h后PBS，清洗得到抗原包被后的ELISA板；6.用5%的脱脂奶粉将抗体稀释至不同浓度，进行抗体效价的检测。
[0013]进一步地，所述步骤2中，超声破碎采用的参数为功率200 W、工作3 s、暂停3 s、时间10 min。
[0014]进一步地，碳酸盐溶液和抗原蛋白的加入量为100 μL。
[0015]进一步地，待检抗体的加入量为100 μL，检测中使用的酶标二抗为FITC标记的兔抗鸡IgG。
[0016]本专利技术的优点及有益效果在于：1.本专利技术采用蛋白复性的方法将表达量较高的包涵体蛋白进行纯化、溶解和复性，得到纯度较高的可溶性蛋白，能保证抗原的有效性。
[0017]2.本专利技术采用重组蛋白进行空白ELISA平板的包被，在测定抗体效价时具有较好的灵敏度和重复性，并且具有较好的浓度梯度范围，因此可用于抗体的效价的检测中。
附图说明
[0018]图1 为质粒 pET28a
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Vp3在 E.coli BL 21菌株中的表达情况的电泳图，泳道1：Marker；泳道2：重组蛋白Vp3全菌液；泳道3：重组蛋白Vp3上清液；泳道4：重组蛋白Vp3沉淀；图2 为质粒 pET28a
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Vp3在E.coli BL 21菌株中的表达情况电泳图，泳道1：Marker；泳道2:pET
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30a；泳道3：重组蛋白Vp3沉淀全菌液；泳道4：重组蛋白Vp3沉淀纯化后全菌液；图3为 重组蛋白Vp3纯化前、后的对比图，泳道1：Marker；泳道2
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泳道3：未经纯化的全菌液；泳道4
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泳道5：复性后的蛋白上清液；图4 为抗体稀释倍数后效价的线性关系。
具体实施方式
[0019]为了便于理解本专利技术，下面结合附图和具体实施例，对本专利技术进行更详细的说明。附图中给出了本专利技术的较佳的实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0020]实施例1 一种包涵体蛋白的复性方法，步骤为：（1）取转化后的E.coliBL21感受态细胞在28℃，220 r/min条件下诱导表达24 h，当菌液的OD
600 nm在2.5左右时进行菌液的收集。
[0021]（2）收集菌体沉淀后，用50 mL含有终浓度为1 mM的DTT的NTA缓冲液进行重悬，然后超声促进杂蛋白溶解，超声仪的功率参数为200 W、工作3 s、暂停3 s、时间10 min。然后进行离心处理，离心参数为10000 rpm，4℃离心10 min。
[0022]（3）沉淀以PBS重悬，超声（参数设置为功率 200 W、工作 3 s、暂停 3 s、时间5 min）后进行离心，16000 rpm，4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包涵体蛋白的复性方法，其特征在于，包括：将包涵体蛋白溶于NTA Buffer溶液中，超声促进杂蛋白的溶解；用6 M的盐酸胍溶液溶解包涵体蛋白，将溶解的包涵体蛋白用3 M的盐酸胍进行2倍体积稀释，逐滴滴入复性液中复性48 h；利用PEG 20000将复性后的液体进行100倍浓缩即可得到可溶性蛋白。2.根据权利要求1所述的包涵体蛋白的复性方法，其特征在于，所述的复性液为：每升中含氧化型谷胱甘肽0.308 g，还原型谷胱甘肽1.54 g，EDTA2Na 0.744 g，精氨酸69.68 g，Tris 12.12 g，去离子水； 溶液的pH 8.0。3.根据权利要求1所述的包涵体蛋白的复性方法，其特征在于，所述6 M盐酸胍溶液中含有终浓度为5 mM的DTT。4.一种如权利要求1
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3任一项所述包涵体蛋白的复性方法的用途，其特征在于：该方法抗体检测中，用于对抗原重组蛋白包涵体进行复性。5.一种抗体的检测方法，其中抗原为原核表达的重组蛋白，包括以下步骤：（1）利用重组质粒在大肠杆菌BL21感受态细胞中诱导表达，得含目的蛋白的大肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜新永，刘长太，李纪兆，陈磊，李晓娟，
申请(专利权)人：青岛润达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：