【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法。
技术介绍
1、产气荚膜梭菌噬菌体治疗产气荚膜梭菌感染引起的疾病被公众广泛认可，该方法起效快，无抗生素残留，不会引起细菌耐药性。由于产气荚膜梭菌为厌氧菌，因此在培养的过程中会进行无氧呼吸利用葡萄糖产酸使发酵液ph降低，较低的ph值将影响发酵液噬菌体效价，并且对噬菌体的稳定性产生很大的影响。目前，产气荚膜梭菌噬菌体的制备多采用成品的培养基例如脑心浸出液培养基、tsb培养基、强化梭菌培养基、厌氧肉肝汤培养基等，这些培养基虽然发酵液效价相对稳定，但是工业化生产时成本较高。针对上述中的相关技术，专利技术人发现，为了解决发酵液效价低和不稳定的问题，具体的解决方案有：筛选高效价的噬菌体，此种方法虽然简单，但是对于部分性能优良但效价低的噬菌体不友好；培养基及发酵工艺进行优化，例如，cn117431219a中针对噬菌体rdp-cp-21008中的培养基及发酵工艺，但技术方案仍存在发酵液ph值偏低的问题，导致最终发酵液噬菌体效价低且不稳定的问题；cn117925441a专利中的培养基成分复杂，存在生产成本较高的问题。这些问题的存在不利于产气荚膜梭菌噬菌体的工业化生产，最终导致在养殖业中大规模的应用受到了阻碍。
技术实现思路
1、本专利技术旨在针对现有技术的不足，提供一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法。本专利技术的目的在于，提供了一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，该方法使得生产的噬菌体长期维持效价稳定，该方法通过改善生产过程中ph
2、为解决上述问题，本专利技术提供了如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，包括以下步骤：
4、s1.种子活化：将宿主产气荚膜梭菌种子和产气荚膜梭菌噬菌体种子进行活化，分别获得种子活化后的宿主菌菌液和噬菌体增殖液；所述步骤s1使用试管活化菌种，为一级种子；
5、s2.种子扩增：将步骤s1所述的宿主菌菌液和噬菌体增殖液进行种子扩增，分别获得种子扩增后的宿主菌菌液和噬菌体增殖液；所述步骤s2属于放大扩增，扩增到适合发酵罐生产的接种量，具体为逐级扩大培养，每级扩大10至100倍体积，放大二至三级才能达到发酵罐的接种量；
6、s3.发酵罐扩大生产：将步骤s2制备的宿主菌菌液接种到发酵培养基中，温度为40-45℃，转速为10-30rpm，罐压为0.5-1.0mpa，厌氧培养0-3h，然后再接种步骤s2制备的噬菌体增殖液，温度为35-40℃，转速为40-60rpm，罐压为0.5-1.0mpa，厌氧条件培养0.5-2h，紧接着将温度提高到40-45℃，转速为10-20rpm，罐压维持0.5-1.0mpa，厌氧培养4-6h结束发酵，在线调控ph。
7、如上所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，所述步骤s3中的发酵培养基为工业化发酵培养基、tsb肉汤、厌氧肉肝汤、ftg肉汤中的任意一种。
8、优选的，所述步骤s3中的发酵培养基为工业化发酵培养基，所述工业化生产发酵培养基，包括以下成分：以质量百分比计，1-2％厌氧肉肝汤、1-5％酵母浸粉、0.2-1.5％蛋白胨、1-3％碳源、0.5-0.9％氯化钠、0.002-0.01％氯化镁、0.002-0.01％氯化钙、0.001-0.01％碳酸钙，初始ph为8.0-8.5。如上所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，所述工业化生产发酵培养基中的碳源为葡萄糖、蔗糖或者可溶性淀粉中的任意一种。优选的，所述工业化生产发酵培养基中的碳源为蔗糖。
9、如上所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，所述步骤s3中的发酵培养基的初始ph为6.0-10.0。优选的，所述步骤s3中的发酵培养基的初始ph为8.0。
10、如上所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，所述步骤s3中的在线调控ph具体包括以下步骤：在接种步骤s2制备的噬菌体增殖液后的培养的过程中时刻监测ph变化情况，当ph降到7.0时就及时补加ph发酵调节剂调节ph，每次补加10ml，5min后检测ph是否达到7.5，若达到则停止补加，未达到继续补加，将整个发酵过程中ph值维持在6.5-7.5。优选的，将整个发酵过程中ph值维持在6.8-7.4。优选的，所述ph发酵调节剂为1mol/l氢氧化钠溶液。优选的，当ph降到7时开始补加ph发酵调节剂氢氧化钠溶液最终发酵液效价较高。
11、如上所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，所述步骤s3中，所述的宿主菌菌液和噬菌体增殖液的最佳接种时间间隔为0.5-2h。优选，所述步骤s3中，所述的宿主菌菌液和噬菌体增殖液的最佳接种时间间隔为0.5h。
12、如上所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，所述产气荚膜梭菌噬菌体选自产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22001、产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-21008、产气荚膜梭菌噬菌体rdpcp23006、产气荚膜梭菌噬菌体rdpcp23040中的任意一种；其中，所述产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22001于2023年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45448；所述产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-21008于2022年4月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.45091；所述产气荚膜梭菌噬菌体rdpcp23006于2023年06月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45573；产气荚膜梭菌噬菌体rdpcp23040于2023年06月12日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45583。
13、第二方面，基于同一个专利技术构思，本专利技术提供了一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法得到的噬菌体发酵产品。该噬菌体产品在4℃条件下保存35天，效价基本保持在同一个数量级，该噬菌体产品在37℃条件下下保存35天，效价下降不到两个数量级，由此可见，本专利技术的在线调控ph的生产工艺不仅提高了噬菌体发酵液的生产效价，而且，提高了噬菌体的稳定性，产生了预料不到的技术效果。
14、如上所述的噬菌体发酵产品，其特征在于，所述噬菌体发酵产品的效价≥107pfu/ml。
15、与现有的技术相比，本专利技术效果和优点是：
16、1、本专利技术提供的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，选择采用工业化发酵培养基，效价都稳定在107pfu/ml以上，且本培养基相比较其他几种培养基成本更低，更加适合工业化生产使用。
17、2、本专利技术提供的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，最终的宿主菌和噬菌体的最佳接种本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述步骤S3中的发酵培养基为工业化发酵培养基、TSB肉汤、厌氧肉肝汤、FTG肉汤中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述步骤S3中的发酵培养基为工业化发酵培养基，所述工业化生产发酵培养基，包括以下成分：以质量百分比计，1-2％厌氧肉肝汤、1-5％酵母浸粉、0.2-1.5％蛋白胨、1-3％碳源、0.5-0.9％氯化钠、0.002-0.01％氯化镁、0.002-0.01％氯化钙、0.001-0.01％碳酸钙，初始pH为8.0-8.5。
4.根据权利要求3所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述工业化生产发酵培养基中的碳源为葡萄糖、蔗糖或者可溶性淀粉中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述步骤S3中的发酵培养基的初始pH为6.0-10.0。
6.根据权利要求3
7.根据权利要求3所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述的宿主菌菌液和噬菌体增殖液的最佳接种时间间隔为0.5-2h。
8.根据权利要求1所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述产气荚膜梭菌噬菌体选自产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22001、产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-21008、产气荚膜梭菌噬菌体RDPCP23006、产气荚膜梭菌噬菌体RDPCP23040中的任意一种；其中，所述产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22001于2023年03月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.45448；所述产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-21008于2022年4月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45091；所述产气荚膜梭菌噬菌体RDPCP23006于2023年06月12日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.45573；产气荚膜梭菌噬菌体RDPCP23040于2023年06月12日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45583。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法得到的噬菌体发酵产品。
10.根据权利要求9所述的噬菌体发酵产品，其特征在于，所述噬菌体发酵产品的效价≥107pfu/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述步骤s3中的发酵培养基为工业化发酵培养基、tsb肉汤、厌氧肉肝汤、ftg肉汤中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述步骤s3中的发酵培养基为工业化发酵培养基，所述工业化生产发酵培养基，包括以下成分：以质量百分比计，1-2％厌氧肉肝汤、1-5％酵母浸粉、0.2-1.5％蛋白胨、1-3％碳源、0.5-0.9％氯化钠、0.002-0.01％氯化镁、0.002-0.01％氯化钙、0.001-0.01％碳酸钙，初始ph为8.0-8.5。
4.根据权利要求3所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述工业化生产发酵培养基中的碳源为葡萄糖、蔗糖或者可溶性淀粉中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述步骤s3中的发酵培养基的初始ph为6.0-10.0。
6.根据权利要求3所述的一种提升产气荚膜梭菌噬菌体效价的方法，其特征在于，所述步骤s3中的在线调控ph具体包括以下步骤：在接种步骤s2制备的噬菌体增殖液后的培养的过程中时刻监测ph变化情况，当ph降低到7.0以下时及时补加ph发酵调节剂调节ph，将整个发酵过程中ph值维持在6.5-7.5。
7.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜新永，刘长太，马如霞，白静，侯连娜，
申请(专利权)人：青岛润达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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