本发明专利技术涉及微生物和食品技术领域，具体涉及到一种高转化率、产蛋白菌株选育方法及其菌株发酵生产应用。本发明专利技术提供镶片镰孢霉突变菌株，尤其是保藏编号为CGMCC NO.40423的TB04菌株，相较于普通镶片镰孢霉，其蛋白含量、生长速度均明显提高，能够利用农副产品为碳源或氮源，且发酵菌丝蛋白中氨基酸种类齐全，含有人体所需的各种必需氨基酸，具有广泛的应用价值。值。
【技术实现步骤摘要】
高产蛋白的镶片镰孢霉及其在发酵生产蛋白的应用
[0001]本专利技术涉及食品
，具体涉及到一株高转化率、高产菌丝蛋白的镶片镰孢霉及其在生产菌丝蛋白中的应用。
技术介绍
[0002]菌丝蛋白是有镶片镰孢霉发酵生产的多细胞蛋白质，与其它蛋白来源相比，发酵蛋白营养全面，生产原料易得，周期短，单位面积产率高，且具有不受环境和气候的影响、可连续生产、绿色环保等优势，市场前景广阔。发酵过程中，乙醇作为主要副产物，能够将碳分流，至糖转化率降低。因此抑制ADH活性，降低丙酮酸向乙醇支路的转化，提高糖转化率。
[0003]丙烯醇是一种有毒物质，但对细胞的毒性并不是致死的，当丙烯醇在ADH的催化下氧化成丙烯醛时，这种不饱和醛的毒性远大于丙烯醇。当细胞在加有一定浓度的丙烯醇平板上培养时，只有ADH活性减低的细胞才能生长。M. CIRIACY等（M. CIRIACY. Genetics of alcohol dehydrogenase in Saccharomycescerevisiae. I. Isolation and genetic analysis of adh mutants. Mutation Research, 1975, 29:315
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326）利用该方法曾多次用于并成功筛选到酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的ADH缺陷型突变株，通过分析这些突变株表型的变化研究缺陷ADH的生理功能；Cristina Mazzoni等（Cristina Mazzoni, et al. CharacterizationofaKluyveromyceslactismutantwithalteredregulation of mitochondrial alcohol dehydrogenases. FEMS Yeast Res. 2006, 6(3):421
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7. ）同样利用此方法筛选获得ADH活性降低菌株。
[0004]镶片镰孢霉发酵生产菌丝蛋白过程中，乙醇作为主要的副产物存在，利用丙烯醇诱变方法筛选低乙醇产量菌株，其方法方便、经济，且不引入外源基因，属于化学诱变范畴。
技术实现思路
[0005]针对现实的需求，本专利技术要解决的技术问题是如何获得乙醇产量低菌种和/或如何获得生长速度快的菌种和/或如何获得底物利用广泛的菌种和/或如何获得适用于菌丝蛋白生产的菌种。
[0006]本专利技术提供了一种利用丙烯醇筛选ADH活性降低的菌株育种方法，利用该方法筛选获得一株镶片镰孢霉TB04，其保藏号为CGMCC NO. 40423。
[0007]示例性地，所述育种方法中丙烯醇添加到培养基，其浓度为10 mM
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120mM之间。
[0008]示例性地，所述育种方法中丙烯醇的浓度由50 mM逐渐增加至100 mM，从而获得乙醇产量低的镰孢菌株TB04。
[0009]示例性地，镰孢菌TB04以TB01为出发菌株，通过丙烯醇诱变而得到。
[0010]本专利技术还提供所述的突变菌株在制备菌丝蛋白中的应用。
[0011]优选地，其通过发酵的方式发酵所述突变菌株以生产菌丝蛋白。
[0012]更优选地，农副产品原料进行发酵。更具体地，所述农副产品原料是大豆糖蜜和/或蔗糖糖蜜。
g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，用水定容至1000mL，调节pH至5.5，121℃灭菌15min。
[0025]甘蔗糖蜜发酵培养基：称取甘蔗糖蜜60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，用水定容至1000mL，调节pH至5.5，121℃灭菌15min。
[0026]大豆糖蜜发酵培养基：称取大豆糖蜜60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，用水定容至1000mL，调节pH至5.5，121℃灭菌15min。
[0027]实施例1、镶片镰孢霉TB04的获得本实施例中以镶片镰孢霉Fusarium venenatumTB01（本实验室保藏，专利CN112226373A）为出发菌株，利用丙烯醇诱变筛选获得镶片镰孢霉TB04：菌株孢子悬液的制备取斜面保存的镶片镰孢霉TB01划线接种于产孢培养基平板中，28℃恒温培养7
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9 d，待平板表面长满镶片镰孢霉菌体，用接种环轻轻刮取表面的孢子，加入生理盐水冲洗三次，吸取孢子悬液转移至锥形瓶中，加入少了玻璃珠，振荡10 min使孢子充分分散，脱脂棉过滤，得到镶片镰孢霉孢子悬浮液。通过血球计数法计算镶片镰孢霉孢子浓度，调整孢子悬浮液终浓度为1ｘ106CFU/ml。于4℃保存备用。
[0028]野生型菌株对丙烯醇的耐受性试验取制备的TB01的孢子悬浮液，按一定稀释度（10
‑3，10
‑4，10
‑5）取200ul涂布于含有0，20，40，80，100，120，140，160 mM丙烯醇的PDA平板上，置于30℃培养箱，观察平板生长情况。试验过程中各个处理均重复３次。以不添加丙烯醇样品（C s）为对照，通过平板菌落计数法计算丙烯醇的致死率，绘制菌株致死率曲线（附图1），由曲线获知，在80mM丙烯醇的PDA中，孢子的死亡率为50%以上，因此选择80 mM丙烯醇作为初始诱变浓度。其计算公式如下：致死率公式为：致死率=（U
‑
T）/U*100%，U为未诱变菌落数（C s），T为诱变后菌落数。
[0029]缺陷型突变株的筛选过程1）取制备的TB01的孢子悬浮液稀释10
‑4倍，取200 ul涂布与80 mM丙烯醇的PAD平板中，30℃，培养48 h；2）挑取平板中生长的单菌落转接与无机盐培养基中，发酵48后取菌液测定乙醇产量；3）将乙醇产量最低菌株接种与产孢培养基平板，按照孢子悬液的方法制备孢子，稀释10
‑4倍，取200 ul涂布与100mM丙烯醇的PAD平板中，30℃，培养48 h；4）挑取平板中生长的单菌落转接无机盐培养基中，发酵48后取菌液测定乙醇产量；5）重复步骤3、4，根据突变菌株乙醇产量，提高丙烯醇浓度，丙烯醇浓度的提高过程：80mM、100 mM、120mM；6）将在120mM丙烯醇平板中生长的单菌落接种至PDA平板中保存，获得8株初筛菌株。
[0030]突变菌株复筛将初筛8株突变菌株分别接种与3 mL的无机盐液体培养中，30℃培养48h；取2 mL菌液接种与50 mL无机盐液体培养于250 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ。发酵结束后用布氏漏斗过滤，收集菌体，105℃烘干3 h至恒重，利用并用HPLC检测发酵液中葡萄糖、乙醇含量。
[0031]称取0.1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种镶片镰孢霉（Fusarium venenatum）或其突变体，其中所述镶片镰孢霉的保藏编号为CGMCC NO. 40423。2.如权利要求1所述的镰孢霉或其突变体，其特征在于，所述突变体是由不同浓度的丙烯醇诱变而得到的。3.如权利要求2所述，诱变是通过丙烯醇添加到培养基中进行诱变，其浓度范围在10 mM
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120mM之间。4.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的镰孢霉或其突变体在生产菌丝蛋白中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，其通过发酵的方式发酵所述突变菌株以生产菌丝蛋白。6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述发酵是利用农副产品原料为碳源进行发酵。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述农副产品原料是大豆糖蜜和/或甘蔗糖蜜。8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，采用葡萄糖为碳源进行发酵，所述葡萄糖发酵培养基为：每1000m...
【专利技术属性】
技术研发人员：王钦宏，齐显尼，高洁，鲍欢，张媛媛，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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