本发明专利技术公开了一种皮肤年轻化蛋白标志物—ACLY蛋白及其无创提性取方法。公开了ACLY蛋白在辅助判断皮肤年轻化程度中的提取检测方法及应用，旨在从根源上找到皮肤年轻化的内在因素，在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，保持年轻化皮肤，另外可以正确判断皮肤的皮肤年轻化程度以及判断皮肤年轻化的生理年龄是否与实际年龄相符，为美容或者医学美容提供参考和方向。容提供参考和方向。容提供参考和方向。
【技术实现步骤摘要】
一种皮肤年轻化蛋白标志物
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ACLY蛋白及其无创提性取方法
[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种皮肤年轻化蛋白标志物—ACLY蛋白及其无创性提取方法。
技术介绍
[0002]皮肤年轻化的标准：是皮脂分泌量适中,皮肤既不干也不油,肤色红润细腻,富有弹性,厚薄适中,毛孔较小,对外界的刺激不敏感,PH值为5
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5.6。
[0003]随着人们生活水平的提高，人们越来越重视皮肤保养，但通常只是关注皮肤衰老的外在表现，比如皱纹、色斑、以及毛孔粗细程度等信息，并由此来判断皮肤的年轻程度，这种判断皮肤年轻程度的方法不能从根源上找到保持皮肤年轻化的原因，无法在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，另外正确判断皮肤的年轻程度以及判断衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，也是美容或者医学美容的前提。
[0004]ACLY是ATP柠檬酸合酶，是负责许多组织细胞质乙酰辅酶A合成的主要酶。在先前的研究中，当将一系列众所周知的纯化抗氧化剂应用24小时后，发现正常人皮肤成纤维细胞和正常人皮肤角质形成细胞中 ACLY被上调。大多数抗氧化剂可能会影响皮肤脂质的合成，而乙酰辅酶A是皮脂合成的重要组成部分，可用于许多重要的生物合成途径，包括脂肪形成和胆固醇生成。胆固醇作为角质形成细胞脂质，是连接和稳定表皮的重要成分。它在保持稳定性和保湿性方面起着重要作用。我们推测ACLY主要参与脂肪和胆固醇的产生，这对于维持皮肤屏障功能的稳定性和保持皮肤年轻至关重要。
[0005]目前没有将ACLY蛋白(ATP柠檬酸盐裂解酶)用于辅助判断皮肤年轻程度的先例。
技术实现思路
[0006]一种无创提取皮肤中ACLY蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
[0007](1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；
[0008](2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；
[0009]2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；
[0010]3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置 1小时；
[0011]4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS
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PAGE 进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。
[0012]优选地，表皮皮肤样本中ACLY蛋白基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；
[0013](2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；
[0014]2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；
[0015]3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置 1小时；
[0016]4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS
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PAGE 进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；
[0017](3)检测
[0018]将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过 UACLY蛋白LC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：
[0019]分离：0
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5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5
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160min，流动相B从5％线性升至35％；160
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170min，流动相B从35％升至80％；170
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175min，80％流动相B；176
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180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；
[0020]DDA质谱检测
[0021]经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q
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Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为 30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5；
[0022]DIA质谱检测
[0023]经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q
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Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350
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1500Da 均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5。
[0024]优选地，用于检测ACLY蛋白含量的物质为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；所述用于检测ACLY 蛋白含量的物质为轨道阱高分辨率质谱仪。
[0025]优选地，所述ACLY蛋白的P值为0.005292344。
[0026]优选地，所述ACLY蛋白判断衰老程度及皮肤衰老程度的方法：
[0027]1)取受试者表皮皮肤样本；
[0028]2)检测所得受试者皮肤样本中ACLY蛋白含量；
[0029]3)将步骤2)测得的ACLY蛋白含量与该年龄段正常衰老的人员皮肤中的ACLY蛋白含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度；
[0030]或4)将步骤2)测得本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种无创提取皮肤中ACLY蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS
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PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：表皮皮肤样本中ACLY蛋白基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56℃的水浴中放置1小时；4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS
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PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；(3)检测将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过UACLY蛋白LC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：分离：0
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5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5
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160min，流动相B从5％线性升至35％；160
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170min，流动相B从35％升至80％；170
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨森，张学军，张博，
申请(专利权)人：杨森，
类型：发明
国别省市：
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