一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法技术

本发明专利技术公开了一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法，包括如下步骤：S1：采集珍珠贝，用清水冲洗天然贝母外壳减少体表附着杂质，去除外壳泥沙海藻；S2：开贝取出贝肉和粘液，用纱布过滤分离贝肉和粘液获得初分离黏液；S3：对初分离黏液添加青霉素和链霉素溶液以抑制海洋环境中含有的细菌生长繁殖影响黏液外泌体质量；S4：对初分离黏液液梯度离心得到预处理黏液；S5：采用免疫磁珠法从珍珠贝黏液中分离得到囊泡状纳米颗粒，即得产物。该提取方法具有成本低、来源广、操作简单、且马氏珠母贝可循环获取体表黏液的效果；所获得外泌体能促进人成纤维细胞增殖，能够应用于促进皮肤伤口愈合。合。合。

【技术实现步骤摘要】
一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种从珍珠贝体表黏液制备外泌体的提取方法和应用。

技术介绍

[0002]外泌体和细胞外囊泡是由脂质、蛋白质、核酸等生物因子组成的球形纳米颗粒，目前国际上对于细胞外囊泡和外泌体并没有明确的分类，通常情况下，将他们称为囊泡状纳米颗粒。作为一种细胞分泌的囊泡状纳米颗粒，外泌体可以在细胞之间传递物质信息，因此外泌体已被应用于多种疾病的治疗，如抗肿瘤、抗炎症及抗氧化等。由于外泌体是细胞产物，因此，与其他治疗方法相比，使用外泌体作为治疗方法具有更低的细胞毒性和更高的生物相容性。免疫磁珠分离技术是一项基于抗原一抗体结合作用发展起来的免疫学技术。它主要是靠在磁珠表面修饰氨基、羧基、链霉亲和素等基团，利用这些基团可以和抗体共价或非共价偶联，可用于结合相应的抗原，在外加磁场的作用下可达到相应抗原物质的分离，广泛应用于核酸提取和膜结构物质分离如细胞分离领域。外泌体分布在许多生物体的体液和细胞中，但大多数外泌体的分离来源主体仍然是人类细胞，如间充质干细胞。然而，人源细胞外泌体存在许多局限性，如分离产量低和分离成本高。因此，寻找新的外泌体来源来取代人类细胞来源外泌体显得尤为重要。
[0003]有研究发现外泌体已从牡蛎中分离出来，并经过鉴定，它们具有相关促进伤口修复特性，而在海洋生物中，也有报道发现从海参中分离出具有类似促进伤口修复作用的细胞外囊泡。如专利CN114480249A公开了一种马氏珠母贝黏液用于提取外泌体的用途、外泌体及其提取方法和应用，采用超速离心法从马氏珠母贝黏液中分离得到囊泡状纳米颗粒，并鉴定为外泌体，由此为从海洋生物中提取生物活性外泌体提供了参考，同时也提高了马氏珠母贝的利用价值，该专利从马氏珠母贝黏液中提取的外泌体能够增强细胞活力，降低细胞内ROS水平，抑制NF
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κB和NLRP3通路的激活，降低相关炎症因子mRNA的表达水平，具有一定的抗炎作用，但上述专利的研究还存在一定的局限、不够深入。此外，有研究成功从鳕鱼黏液中分离和提取出外泌体，并发现它们含有免疫相关蛋白。然而，与人类和植物来源的外泌体相比，从海洋生物中提取外泌体的研究仍相对缺乏。

技术实现思路

[0004]本专利技术解决的问题是从海洋生物珍珠贝中提取一种新型的外泌体，并研究该外泌体的应用。
[0005]本专利技术提供了一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法，包括如下步骤：
[0006]S1：采集珍珠贝，用清水冲洗天然贝母外壳减少体表附着杂质，去除外壳泥沙海藻；
[0007]S2：开贝取出贝肉和粘液，用纱布过滤分离贝肉和粘液获得初提取黏液；
[0008]S3：对初分离黏液添加青霉素和链霉素以抑制海洋环境中含有的细菌生长繁殖影
响黏液外泌体质量；
[0009]S4：对初分离黏液液梯度离心得到预处理黏液；
[0010]S5：通过外泌体分离免疫磁珠法从珍珠贝黏液中分离得到囊泡状纳米颗粒，即得产物。
[0011]优选的，在步骤S3中添加的青霉素和链霉素溶液的最终浓度为1％。
[0012]优选的，所述步骤S4中对初分离黏液进行三次液梯度离心，第一次离心处理的离心力为300g，离心时间为10min，取上清；第二次离心处理的离心力为2000g，离心时间为10min，取上清；第三次离心处理的离心力为10000g，离心时间为30min，取上清。
[0013]优选的，所述外泌体分离采用CD9和CD63抗体包被的免疫磁珠法。
[0014]优选的，所述步骤S5中的处理过程基于CD63和CD9抗体偶联磁珠从珍珠贝黏液中分离得到囊泡状纳米颗粒，具体步骤包括：
[0015]S501、用磁珠表面功能化处理修饰CD63和CD9抗体，漩涡震荡链霉亲和素修饰磁珠，取磁珠悬液用分离缓冲液清洗磁力架分离磁珠，清洗完成后用分离缓冲液悬浮，然后向所得悬浮液中加入CD63、CD9单克隆抗体，颠倒旋转孵育；孵育完成后用分离缓冲液清洗，磁力架分离磁珠，再用分离缓冲液悬浮，即得到表面修饰有CD63和CD9抗体的功能化磁珠；
[0016]S502、过滤待测珍珠贝黏液上清液样本，加入过滤后的珍珠贝黏液上清液样本与CD63和CD9抗体偶联磁珠悬浮液，孵育完成后用磷酸缓冲盐溶液清洗磁力架分离磁珠，即得到磁珠
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抗体
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外泌体复合物；
[0017]S503、用胰蛋白酶洗涤磁吸附物，并将洗涤后的磁吸附物与洗脱缓冲液混合并孵育，使固液分离，收集外泌体提取液，重悬保存。
[0018]优选的，在步骤S503中，将收集外泌体提取液重悬保存到
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80℃。
[0019]本专利技术提供一种外泌体，采用如上所述的提取方法提取得到。
[0020]本专利技术提供一种上述的外泌体在制备促进皮肤创伤愈合的药物或器械中的应用。
[0021]本专利技术至少具备以下其中一个优点：
[0022](1)本专利技术提出这一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法，流程简单，黏液提取效率高，珍珠贝体表分泌黏液可反复提取，通过纱布分离和梯度离心的方法能够有效去除杂质颗粒，分离获得的溶液清澈，无肉眼可见颗粒，经此方法初步分离的珍珠贝表粘液有助于进一步的外泌体提取，克服了现有海洋生物体表黏液提取缺点，同时充分展现了海洋生物外泌体提取优势，成本低，来源广，而且珍珠贝可反复利用，高效的提取工艺为研究海洋生物体表黏液提供了研究基础。
[0023](2)珍珠贝体表黏液制备外泌体能促进人成纤维细胞增殖，能够应用于促进皮肤伤口愈合，而且可用于促进、发现新的促进创伤伤口愈合药物。
[0024]上述说明仅是本申请技术方案的概述，为了能够更清楚了解本申请的技术手段，从而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本申请的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下以本申请的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
[0025]根据下文结合附图对本申请具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本申请的上述及其他目的、优点和特征。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
[0027]图1为本专利技术分离珍珠贝体表黏液实物图；
[0028]图2为本专利技术从珍珠贝体表黏液制备外泌体粒径检测的结果图；
[0029]图3为本专利技术从珍珠贝体表黏液制备外泌体的电镜图；
[0030]图4为本专利技术的制备得外泌体WB验证外泌体标志物CD63蛋白鉴定结果图；
[0031]图5为本专利技术的制备得外泌体WB验证外泌体标志CD9蛋白鉴定结果图；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：采集珍珠贝，用清水冲洗天然贝母外壳减少体表附着杂质，去除外壳泥沙海藻；S2：开贝取出贝肉和粘液，用纱布过滤分离贝肉和粘液获得初分离黏液；S3：对初分离黏液添加青霉素和链霉素以抑制海洋环境中含有的细菌生长繁殖影响黏液外泌体质量；S4：对初分离黏液液梯度离心得到预处理黏液；S5：采用免疫磁珠法从珍珠贝黏液中分离得到囊泡状纳米颗粒，即得产物。2.根据权利要求1所述的一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法，其特征在于，在步骤S3中添加的青霉素和链霉素溶液的最终浓度为1％。3.根据权利要求1所述的一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S4中对初分离黏液三次液梯度离心；第一次离心处理的离心力为300g，离心时间为10min，取上清；第一次离心处理的离心力为2000g，离心时间为10min，取上清；第一次离心处理的离心力为10000g，离心时间为30min，取上清。4.根据权利要求1所述的一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法，其特征在于，所述外泌体分离采用CD9和CD63抗体包被的免疫磁珠法。5.根据权利要求4所述的一种从珍珠贝体表黏液提取外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S5中的处理过程基于CD63和CD9抗体偶联...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑立，赵劲民，许胜，蔡捷，马珂，罗艳，周波，曾韬，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：