一种CD47-SIRPα信号轴生物学活性的体外检测方法技术

本发明专利技术涉及活性检测技术领域，具体来说是一种CD47

【技术实现步骤摘要】
一种CD47
‑
SIRP
α
信号轴生物学活性的体外检测方法


[0001]本专利技术涉及活性检测
，具体来说是一种CD47
‑
SIRPα信号轴生物学活性的体外检测方法。

技术介绍

[0002]免疫系统已经进化到能够检测和破坏患病的靶细胞，比如被病原体感染或癌变的细胞，这些细胞如果不被灭活，就会有潜在的危害，包括巨噬细胞、中性粒细胞和小胶质细胞在内的髓样效应细胞介导的靶细胞清除或修饰，在维持组织内稳定的过程中起到核心作用，该过程通过受体与配体结合传递激活或抑制信号,抑制性受体也称为免疫检查点，包括一系列包含免疫受体酪氨酸抑制性基序(immunoreceptor tyrosine
‑
based inhibitory motif，ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine
‑
based switch motif，ITSM)的受体，诸如结合CD47的SIRPα，结合MHC I的LILRB1，结合CD24的Siglec
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10，结合PD
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L1的PD
‑
1等，肿瘤细胞往往通过过度表达免疫检查点的配体来实现免疫逃逸的，在免疫逃逸过程中，PD
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L1/PD
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1作为“不要发现我”的信号，而CD47
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SIRPα信号轴作为“不要吃我”的信号，PD
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L1与T细胞表面的PD/>‑
1受体结合抑制癌细胞的杀伤；而CD47与巨噬细胞表面SIRPα受体的结合抑制癌细胞的清除。
[0003]CD47蛋白(也被称为IAP、MER6或OA3)是一种在正常细胞和癌细胞中广泛表达的糖蛋白，由一个单独的细胞外结构域、一个具有5次跨膜区的高度疏水蛋白结构域和一个短选择性拼接的羧基端胞质尾区组成，SIRPα的限制性表达模式相反，CD47在体内不同类型的细胞中广泛表达，不同组织中CD47蛋白亚型的表达也不同，但在胶质母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、肝细胞癌等多种类型肿瘤患者中高表达，同时CD47高表达与癌症患者的低生存率相关，CD47的表达是由多种转录因子触发的，包括NFκB、Myc和HIF等。
[0004]SIRP蛋白家族包含五个成员：SIRPα、SIRPβ1、SIRPβ2、SIRPγ和SIRPδ，中SIRPα(也被称为PTPNS1,SHPS1,CD172A和P84)和SIRPγ(也被称为CD172b)，均可以与CD47结合，但SIRPα与CD47的亲和力是SIRPγ的10倍，
[0005]SIRPα包含有三个免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域的细胞外区域，在非洲、日本、中国和高加索人群中已经报道了配体结合域多态性的等位变异，其中三种(SIRPαV1、SIRPαV2和SIRPαV8)是人类群体中最突出的单倍型，共占约90％，其显著的多态性，包括在配体结合域中显著不同的等位基因，提示了可能的进化压力，SIRPα的胞内区域包含抑制受体活性所必需的ITIM和ITSM基序；而SIRPγ的胞内区域仅有4个氨基酸，没有明显的信号转导功能。
[0006]CD47/SIRPα检查点于1999年被首次发现，可抑制吞噬细胞的吞噬作用，促进肿瘤的免疫逃逸。临床分析显示，CD47在多种实体肿瘤中高表达。阻断CD47
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SIRPα的相互作用可以断增强巨噬细胞和树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)的吞噬作用，激活固有免疫反应。而DCs的吞噬作用激活适应性免疫反应，导致T细胞激活。这表明抑制CD47
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SIRPα信号轴不仅可以增强先天免疫，还可以促进适应性免疫反应。所以，靶向CD47
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SIRPα信号轴的肿瘤免
疫治疗具有非凡的潜力。
[0007]CD47
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SIRPα信号轴的作用机理很容易让人联想到PD
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1/PD
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L1，阻断PD
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1与PD
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L1的相互作用可以帮助T细胞识别“好与坏”，进而激活T细胞杀伤活性，正是由于此，CD47/SIRPα也一直被认为是继PD
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1/PD
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L1之后，肿瘤免疫领域的下一个重要靶点，目前，一些靶向CD47/SIRPα的抗体或药物已进入临床试验，在相关抗体或药物研发过程中，普遍采用原代细胞(如人外周血源性巨噬细胞，小鼠骨髓来源的巨噬细胞)作为效应细胞或动物实验来评价相关药物生物活性(WO 2019/184912A1；US 2021/0079091A1；Cell.2009Jul 23；138(2):286
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299；Proc Natl Acad Sci U S A.2012Apr 24；109(17):6662
‑
7，WO2021197401A1)。然而，原代细胞或动物实验过程中往往需要对靶细胞和效应细胞进行标记和免疫染色以达到流式细胞实验的要求，操作过程十分繁琐，实验过程中存在很多导致误差产生的操作。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供一种CD47
‑
SIRPα信号轴生物学活性的体外检测方法，构建新型检测体系，应用HEK293
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CD47
‑
CMV
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lucferase报告基因细胞株和RAW264.7
‑
SIRPα细胞株进行实验。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术设计一种CD47
‑
SIRPα信号轴生物学活性的体外检测方法，包括构建HEK293
‑
CD47
‑
CMV
‑
luciferase报告基因细胞株与RAW264.7
‑
SIRPα细胞株，对HEK293
‑
CD47
‑
CMV
‑
luciferase报告基因细胞株和RAW264.7
‑
SIRPα细胞株进行功能验证，加入CD47抗体后检测信号通路是否阻断。
[0010]优选的:所述的HEK293
‑
CD47
‑
CMV
‑
luciferase报告基因细胞株的构建方法具体是:选取HEK293作为宿主细胞，选取质粒与CMV启动子，将CD47与CMV在电极杯中进行电转，将电转后的细胞转入六孔板进行培养，添加CD47与CMV携带的对应抗性药物，杀死不含有CD47质粒与CMV启动子的细胞，观察细胞状态，更换含有相应抗性的培养基，待细胞生长至60％以上平皿时，转入T25瓶中进行扩大培养，用有限稀释法按照每孔0.5个细胞进行铺板，然后进行显微观察，选取孔内仅含有一个细胞群落的进行扩大培养，再进行FACS检测转入基因的表达量情况，选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CD47
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SIRPα信号轴生物学活性的体外检测方法，其特征在于，包括构建HEK293
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CD47
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CMV
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lucferase报告基因细胞株与RAW264.7
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SIRPα细胞株，对HEK293
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CD47
‑
CMV
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lucferase报告基因细胞株和RAW264.7
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SIRPα细胞株进行功能验证，加入CD47抗体后检测信号通路是否阻断。2.如权利要求1所述的一种CD47
‑
SIRPα信号轴生物学活性的体外检测方法，其特征在于所述的HEK293
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CD47
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CMV
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lucferase报告基因细胞株的构建方法具体是:选取HEK293作为宿主细胞，选取质粒与CMV启动子，将CD47与CMV在电极杯中进行电转，将电转后的细胞转入六孔板进行培养，添加CD47与CMV携带的对应抗性药物，杀死不含有CD47质粒与CMV启动子的细胞，观察细胞状态，更换含有相应抗性的培养基，待细胞生长至60%以上平皿时，转入T25瓶中进行扩大培养，用有限稀释法按照每孔0.5个细胞进行铺板，然后进行显微观察，选取孔内仅含有一个细胞群落的进行扩大培养，再进行FACS检测转入基因的表达量情况，选取阳性率85%以上的细胞进行扩培，保存。3. 如权利要求1所述的一种CD47
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SIRPα信号轴生物学活性的体外检测方法，其特征在于所述的RAW264...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔灵英，张伟，刘家华，
申请(专利权)人：上海甲贝医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：