制备用于蛋白质组学分析的样品的方法技术

本文提供了制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法。在示例性实施例中，所述方法包括(a)使包括蛋白质的血液样品与包括抗凝剂(AC)和醛释放剂(AR)的保护剂接触以获得混合物，任选地，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的血液收集管(BCT)中，以及(b)从所述混合物中分离包括蛋白质或蛋白质源的级分以产生蛋白质样品或蛋白质源样品，其中所述方法的步骤在不存在外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学和多肽组学分析。学和多肽组学分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备用于蛋白质组学分析的样品的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年7月1日提交的美国临时申请第63/047,143号的优先权的权益，所述美国临时申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。

技术介绍

[0003]术语“蛋白质组”最早由Marc Wilkins创造，是指细胞、组织或生物体表达的整套蛋白质。因此，“蛋白质组学”是对在给定时间点细胞、器官或生物体中存在的蛋白质组的研究和表征。与基因组不同，蛋白质组由于时间和空间的变化而变得复杂。经常调节蛋白质活性的翻译后修饰进一步使蛋白质组的研究变得非常复杂。然而，这些蛋白质组的变化和改变对于鉴定分子标记非常有用，所述分子标记用作多种疾病的诊断工具。临床蛋白质组学领域致力于在疾病背景下鉴定和验证此类分子标记。Ahmad等人,《蛋白质组学与基因组学杂志(J Proteomics and Genomics)》1(1):103(2014)。临床蛋白质组学研究人员使用的技术数量不断增加，并且包含涉及电泳和免疫分析基本技术的方法到更复杂的方法，如质谱法或其版本，包含例如电子喷雾电离(ESI)、液相色谱法
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质谱法联用(LC
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MS)和表面增强激光解吸电离(SELDI)。定量蛋白质组学领域已经出现，用于对给定样品中的蛋白质进行绝对定量，并且包含如同位素编码亲和标签(ICAT)、利用am进行的稳定同位素标记(SILAC)和用于相对和绝对定量的同量异位标签(iTRAQ)等技术。Ahmad等人,2014,同上。
[0004]无论利用哪些技术，对于通过蛋白质组学分析产生的数据的质量、准确性和可靠性最重要的是样品的稳定性。“预分析技术，尤其是样品储存、运输和处理是有效和无偏结果的关键因素。已知重复冻融循环期间含量较低的蛋白质的损失或蛋白质修饰或不当储存会影响结果。”Ahmad等人,2014,同上。样品在室温下通常不稳定并且必须在
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80℃下储存。除了避免重复的冻融循环外，还必须小心避免蛋白酶，并且在从原始血液或组织制备样品期间或之后，向样品中添加可商购获得的蛋白酶抑制剂是解决所述问题的传统做法。“总之，可以说，蛋白质组学中样品储存和稳定性的最大问题是温度和环境蛋白酶”。Ahmad等人,2014,同上。
[0005]通常情况下，在收集后不久将样品(例如，血液样品)储存在冷藏温度下是不可能或不方便的。另外，当蛋白质组学分析涉及大量样品时，可商购获得的蛋白酶抑制剂的成本会很高。因此，本领域需要制备用于蛋白质组学分析的样品的改进的方法。

技术实现思路

[0006]本文首次呈现的数据证明了在不存在另外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下在包括本文所述的保护剂的血液收集管(BCT)中收集全血，并且随后处理收集的血液样品进行蛋白质组学分析的可行性。在不受任何特定理论约束的情况下，如本文所述，保护剂的使用为用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的制备提供了许多益处。如本文进一步所述，保护剂使细胞(例如，红细胞、白细胞、血小板)稳定，从而减少或防止不需要的细胞裂解和随后细胞蛋白质释放到样品中。在某些情况下，此类细胞蛋白质被认为是用于蛋白质组学分
析的蛋白质样品的污染物，因为这些细胞蛋白质可以掩盖样品中低丰度蛋白质的存在，并且阻碍样品中蛋白质的鉴定和/或定量。在不受任何特定理论约束的情况下，保护剂还使样品中的蛋白水解酶失活，并且因此减少或消除对另外的蛋白水解酶抑制剂的需求。在目前公开的方法中使用保护剂减少了蛋白水解酶介导的降解的影响，并增加了收集的血液样品的稳定性。
[0007]因此，本公开提供了一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法。在一些实施例中，所述蛋白质组学分析是多肽组学分析。在示例性实施例中，所述方法包括(a)使包括蛋白质的血液样品与包括基于柠檬酸盐的抗凝剂(AC)和醛释放剂(AR)的保护剂接触以获得混合物，任选地，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的血液收集管(BCT)中，或者将所述血液样品直接从受试者抽取到包括所述保护剂的BCT中，以及(b)从所述混合物中分离包括蛋白质的级分以产生适合于蛋白质组学分析的蛋白质样品。在示例性方面，所述方法的步骤(a)和(b)在不存在另外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行(例如，所述方法的步骤(a)和(b)在不添加或使用所述保护剂之外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行)。在示例性方面，与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的所述蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0。在示例性方面，在储存至少48小时后存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集所述血液样品的约0小时至约4小时内存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％内。在示例性方面，所述方法进一步包括将密封容器中的所述混合物运输到实验室用于蛋白质组学分析，任选地，其中所述密封容器是包括所述保护剂的密封BCT。在示例性实施例中，所述方法包括(a)使包括蛋白质的血液样品与包括AC和AR的保护剂接触以获得混合物，任选地，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的BCT中，或者将所述血液样品直接从受试者抽取到包括所述保护剂的BCT中，(b)从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分，以及(c)任选地裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品。在示例性方面，所述蛋白质样品适合于蛋白质组学分析，并且其中所述方法的步骤(a)和(b)在不存在另外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行(例如，所述方法的步骤(a)和(b)在不添加或使用所述保护剂之外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行)。在示例性方面，与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的所述蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0。在示例性方面，在储存至少48小时后存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集所述血液样品的约0小时至约4小时内存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％内。在示例性方面，所述方法进一步包括将密封容器中的所述混合物运输到实验室用于蛋白质组学分析，任选地，其中所述密封容器是包括所述保护剂的密封BCT。如本文进一步所述，在一些方面，所述保护剂包括AC和AR，其中所述AC既起AC的作用又起蛋白水解酶抑制剂的作用，并且所述方法不添加或使用所述保护剂之外的任何外源性蛋白水解酶抑制剂。
[0008]在另一方面，本文描述了一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括(a)将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的血液收集管(BCT)中，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)
约1g/l至约20g/l茶碱、(iv)约1g/l至约20g/l腺苷和(v)约0.05g/l至约20g/l双嘧达莫组成；(b)任选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括a.使包括蛋白质的血液样品与包括基于柠檬酸盐的抗凝剂(AC)和醛释放剂(AR)的保护剂接触以获得混合物，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的血液收集管(BCT)中，或者将所述血液样品直接从受试者抽取到包括所述保护剂的BCT中，以及b.从所述混合物中分离包括蛋白质的级分以产生适合于蛋白质组学分析的蛋白质样品，其中：(I)步骤(a)和(b)在不存在外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行；(II)与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的所述蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0；(III)在储存至少48小时后存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集所述血液样品的约0小时至约4小时内存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％内；(IV)所述方法进一步包括将密封容器中的所述混合物运输到实验室用于蛋白质组学分析，任选地，其中所述密封容器是包括所述保护剂的密封BCT；或者(V)其任何组合。2.一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括a.使包括蛋白质的血液样品与包括基于柠檬酸盐的抗凝剂(AC)和醛释放剂(AR)的保护剂接触以获得混合物，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的血液收集管(BCT)中，或者将所述血液样品直接从受试者抽取到包括所述保护剂的BCT中，b.从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分，以及c.裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析，其中：(I)步骤(a)和(b)在不存在外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行；(II)与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的所述蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0；(III)在储存至少48小时后存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集所述血液样品的约0小时至约4小时内存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％内；(IV)所述方法进一步包括将密封容器中的所述混合物运输到实验室用于蛋白质组学分析，任选地，其中所述密封容器是包括所述保护剂的密封BCT；或者(V)其任何组合。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质组学分析是多肽组学分析。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述保护剂包括AC与AR的比率为约1:1至约1:6的所述AR和所述AC。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述保护剂包括AC与AR的比率为约1:1至约1:5的
所述AR和所述AC。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述保护剂包括AC与AR的比率为约1:1.2的所述AR和所述AC。7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述基于柠檬酸盐的AC包括酸柠檬酸盐右旋糖(ACD)、柠檬酸盐、柠檬酸盐
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茶碱
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腺苷
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双嘧达莫(CTAD)、柠檬酸盐
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吡哆醛磷酸盐
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tris、柠檬酸盐
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右旋糖
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磷酸盐
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腺嘌呤(CDPA)、柠檬酸盐
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磷酸盐
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右旋糖
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腺嘌呤(CPDA)或其组合。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述保护剂进一步包括红细胞(RBC)稳定剂。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述RBC稳定剂包括环糊精。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述环糊精是α
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环糊精、β
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环糊精或γ
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环糊精。11.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述保护剂包括约50g/l至约100g/lAC。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AR是重氮烷基脲、咪唑烷基脲、1,3,5
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三(羟乙基)
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s
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三嗪、噁唑烷、1,3
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双(羟甲基)
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5,5
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二甲基咪唑烷
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2,4
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二酮、季铵盐
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15、DMDM乙内酰脲、2
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溴
‑2‑
硝基丙烷
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1,3
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二醇、5
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溴
‑5‑
硝基
‑
1,3
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二噁烷、三(羟甲基)硝基甲烷、羟甲基甘氨酸盐、聚季铵盐或其组合。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述AR包括咪唑烷基脲，任选地，其中咪唑烷基脲是所述保护剂中的唯一AR。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述保护剂包括约0.1g/ml至约3g/ml AR。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述保护剂进一步包括胺。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述胺是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、鸟氨酸和S
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腺苷蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或其组合。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述胺是甘氨酸，任选地，其中甘氨酸是所述保护剂中的唯一胺。18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述保护剂包括约20g/l至约60g/l胺。19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中胺的量相对于的量为约1重量份胺比约10重量份AR。20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述保护剂包括不超过约50,000ppm甲醛。21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述保护剂包括(a)柠檬酸盐
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茶碱
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腺苷
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双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲和α
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环糊精；(b)柠檬酸盐
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茶碱
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腺苷
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双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲；(c)柠檬酸盐
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右旋糖
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磷酸盐
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腺嘌呤(CDPA)、咪唑烷基脲和α
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环糊精；或者(d)柠檬酸盐
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右旋糖
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磷酸盐
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腺嘌呤(CDPA)、咪唑烷基脲。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述保护剂是柠檬酸盐
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茶碱
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腺苷
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双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲和α
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环糊精。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约
50g/l至约300g/l右旋糖、(iv)(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤和(vii)约10g/l至约50g/lα
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环糊精组成。24.根据权利要求21所述的方法，其中所述保护剂是柠檬酸盐
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茶碱
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腺苷
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双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(iv)(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤组成。26.根据权利要求21所述的方法，其中所述保护剂是柠檬酸盐
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右旋糖
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磷酸盐
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腺嘌呤(CDPA)、咪唑烷基脲和α
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环糊精。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤和(vii)约10g/l至约50g/lα
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环糊精组成。28.根据权利要求21所述的方法，其中所述保护剂是柠檬酸盐
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【专利技术属性】
技术研发人员：马修，
申请(专利权)人：斯特雷克股份有限公司，
类型：发明
国别省市：