本发明专利技术公开了一种胎盘来源的基质凝胶，通过以下方法制备得到：(1)胎盘组织依次浸泡于氯化钠溶液、尿素溶液A中，分离得到上清液和沉淀；(2)上清液在3500Da截流量透析袋中透析；保留液用含有抗生素的PBS缓冲液透析，得富含细胞因子的保留液；(3)沉淀置于胃蛋白酶溶液中消化处理，再置于尿素溶液B中处理；在14000Da截流量透析袋中透析，得蛋白液；(4)将富含细胞因子的保留液与蛋白液按0.8～1.2:1的体积比混合，即得基质凝胶。本发明专利技术的胎盘来源的基质凝胶，富含与胎盘组织类似的细胞因子和蛋白种类，在细胞增殖上具有明显促进作用；无毒性，并且对于伤口的愈合具有促进作用，可用于治疗皮肤创伤或烫伤。肤创伤或烫伤。肤创伤或烫伤。
【技术实现步骤摘要】
胎盘来源的基质凝胶及其制备方法
[0001]本专利技术涉及一种胎盘来源的基质凝胶及其制备方法，属于生物工程
技术介绍
[0002]应用组织工程技术修复全层皮肤创面和皮肤烫伤在临床试验中是一个热点。目前用于伤口愈合的水凝胶包括合成的水凝胶和天然的基质凝胶，其中，天然的基质凝胶是从组织中提取的，存在来自提取组织的各种细胞因子且比例和种类与原组织类似，更能模拟生物体内细胞外基质的场景，有利于伤口更快更贴近自然地愈合。
[0003]胎盘组织中含有多种生理活性成分，如细胞因子、GFs和氨基酸，在母胎耐受中发挥独特作用，防止胎儿异体移植被排斥。因此，可用于减少同种异体移植中的宿主免疫反应。使用这种人类来源的组织可以大大减少对异种支架的需求，且产后胎盘材料的丢弃使得人胎盘ECM水凝胶的发展成为可能。
[0004]现有技术中制备胎盘水凝胶的技术较为少见，以人胎盘为原料的更少，方法通常为制备脱细胞外基质后再进行酶消，对细胞因子和部分蛋白破坏较大，且部分方法中的基质凝胶由于提取试剂的选择或时间与温度的选择，导致对组织中的蛋白和细胞因子也有较大的破坏；另外还存在凝胶后的透明度较低，制备时间过长，引入其他有毒性的物质等不足之处。
技术实现思路
[0005]针对上述现有技术，本专利技术提供了一种胎盘来源的基质凝胶，其富含细胞因子，且与原组织细胞外基质构成相似，本专利技术还提供了其制备方法。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种胎盘来源的基质凝胶，是通过以下方法制备得到的，包括以下步骤：
[0008](1)预处理：取胎盘组织，将其破碎(使用组织破碎机破碎)，然后浸泡于氯化钠溶液中8～12min以去除细胞；取出，滤干水分，浸泡于尿素溶液A中以进行组织内可溶性蛋白的提取，浸泡2～4天后离心(优选4000rpm，15min)，分离得到上清液和沉淀；
[0009]所述氯化钠溶液是由以下组分组成的(以500ml计)：氯化钠95～105克，1.3～1.7克三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.7～0.8克EDTA，0.11～0.14克乙基马来酰亚胺，余量为超纯水，pH为7.0～8.0；
[0010]优选的，所述氯化钠溶液中氯化钠的浓度为3.4mol/L，是由以下组分组成的(以500ml计)：氯化钠99.25克，1.5143克三羟甲基氨基甲烷，0.75克EDTA，0.125克乙基马来酰亚胺，余量为超纯水，pH为7.4；
[0011]所述尿素溶液A(尿素溶液的浓度为2.5～3.5mol/L)是由以下组分组成的(以500ml计)：尿素70～105克，氯化钠4.0～5.0克，3.0～3.1克Tris，余量为超纯水，pH为7.0～8.0；尿素溶液A属于低浓度尿素，对蛋白变性程度不大，可保留丰富的细胞因子，无毒，且兼顾了提取效率；
[0012]优选的，所述尿素溶液A中尿素的浓度为3mol/L，是由以下组分组成的(以500ml计)：尿素90克，氯化钠4.5克，3.025克Tris，余量为超纯水，pH为7.4；
[0013]进一步地，所述胎盘组织，是去除多余血液的新鲜胎盘组织，或在4℃条件下保存于含有EDTA的PBS缓冲液(1L PBS缓冲液加1.5g EDTA，并调pH至7.4)中的胎盘组织；
[0014]进一步地，所述胎盘组织与尿素溶液A的配比关系为：1g胎盘组织加0.8～1.2ml尿素溶液A；优选的，1g胎盘组织加1ml尿素溶液A；
[0015]进一步地，所述浸泡于氯化钠溶液、浸泡于尿素溶液均是在4℃条件下进行的；
[0016](2)细胞因子的提取：上述上清液，在3500Da截流量透析袋中用50～100倍样品量(体积比)的PBS缓冲液透析20～28小时；保留液离心(优选4000rpm，15min)取上清，继续在3500Da截流量透析袋中用50～100倍样品量(体积比)的PBS缓冲溶液透析20～28小时；保留液离心(优选12000rpm,10min)取上清，用含有抗生素的8～12倍样品量(体积比)的PBS缓冲液透析10～15小时，得富含细胞因子的保留液；
[0017]进一步地，所述含有抗生素的PBS缓冲液中含有青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素。所述青霉素、链霉素的浓度为0.8％～1.2％(重量体积比，单位g/ml)，所述庆大霉素和两性霉素的浓度为0.08％～0.12％(重量体积比，单位g/ml)；优选的，所述青霉素、链霉素的浓度为1％，所述庆大霉素和两性霉素的浓度为0.1％；
[0018](3)蛋白凝胶支架的制备：步骤(1)中的沉淀，称重，置于pH为1.0～2.0的盐酸中处理2.5～3.5h，过滤除去盐酸；再置于胃蛋白酶溶液(浓度为8～12mg/ml，优选10mg/ml)中，消化处理(在20～28℃、摇床120～200rpm/min条件下消化处理20～28小时)，离心(优选12000rpm，10min)收集上清，所得沉淀继续用胃蛋白酶溶液消化处理，离心收集上清；将两次所得上清合并，置于8～12倍样品量(体积比)的尿素溶液B中处理10～14小时；然后在14000Da截流量透析袋中用50～100倍样品量(体积比)的PBS缓冲液透析20～28小时，得蛋白液；
[0019]所述胃蛋白酶溶液是由以下组分组成的：胃蛋白酶800～1200克，pH为1～2的盐酸100ml；优选的，是由以下组分组成的：胃蛋白酶1000克，pH为1的盐酸100ml；
[0020]所述尿素溶液B(尿素溶液的浓度为5～7mol/L)是由以下组分组成的(以500ml计)：尿素150～210克，氯化钠4.0～5.0克，2.9～3.2克Tris，余量为水，pH为7.0～8.0；优选的，所述尿素溶液B(尿素溶液的浓度为6mol/L)是由以下组分组成的(以500ml计)：尿素180克，氯化钠4.5克，3.025克Tris，余量为水，pH为7.4；
[0021]所述沉淀与盐酸、胃蛋白酶溶液的用量配比关系为：1g沉淀加入1.8～2.2ml盐酸；1g沉淀加入1.8～2.2ml胃蛋白酶溶液；优选的，1g沉淀加入2ml盐酸；1g沉淀加入2ml胃蛋白酶溶液；
[0022]其中，先用盐酸预处理沉淀3h左右，可改变沉淀pH值，避免胎盘沉淀组织中残留的弱碱性液体对胃蛋白酶溶液的pH值造成影响，10mg/ml的胃蛋白酶浓度，以及两倍的质量体积比，既可以保证胎盘组织的完全消化，又可以保证被消化后的蛋白溶液的浓度适宜；25℃的消化条件为适宜温度，温度过高会导致消化过度，温度过低会影响消化速度；尿素溶液的浓度为6mol/L，其具有4个作用：一为调节pH至7.4，二为浓缩蛋白，三为提高基质凝胶的透明度，四为对进行灭菌消毒，避免使用灭菌消毒剂；
[0023](4)将步骤(2)所得富含细胞因子的保留液与步骤(3)所得蛋白液按0.8～1.2:1的
体积比混合，即得基质凝胶，具有温敏性和pH敏感性，可用于注射，可用于治疗皮肤创伤或烫伤。
[0024]本专利技术的胎盘来源的基质凝本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种胎盘来源的基质凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)预处理：取胎盘组织，将其破碎，然后浸泡于氯化钠溶液中以去除游离细胞；取出，滤干水分，浸泡于2.5～3.5mol/L的尿素溶液A中以进行组织内可溶性蛋白的提取，浸泡2～4天后离心，分离得到上清液和沉淀；(2)细胞因子的提取：上述上清液，在3500Da截流量透析袋中用PBS缓冲液透析；保留液离心取上清，继续在3500Da截流量透析袋中用PBS缓冲溶液透析；保留液离心取上清，用含有抗生素的PBS缓冲液透析，得富含细胞因子的保留液；(3)蛋白凝胶支架的制备：步骤(1)中的沉淀，置于盐酸中处理，过滤除去盐酸；再置于胃蛋白酶溶液中，进行消化处理，离心收集上清，所得沉淀继续用胃蛋白酶溶液消化处理，离心收集上清；将两次所得上清合并，置于5～7mol/L的尿素溶液B中处理；然后在14000Da截流量透析袋中用PBS缓冲液透析，得蛋白液；(4)将步骤(2)所得富含细胞因子的保留液与步骤(3)所得蛋白液按0.8～1.2:1的体积比混合，即得基质凝胶。2.根据权利要求1所述的胎盘来源的基质凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，胎盘组织是去除多余血液的新鲜胎盘组织，或在4℃条件下保存于含有EDTA的PBS缓冲液中的胎盘组织。3.根据权利要求1所述的胎盘来源的基质凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，氯化钠溶液是由以下组分组成的，以500ml计：氯化钠95～105克，1.3～1.7克三羟甲基氨基甲烷(Tris)，0.7～0.8克EDTA，0.11～0.14克乙基马来酰亚胺，余量为超纯水，pH为7.0～8.0；在氯化钠溶液中的浸泡时间为8～12min。4.根据权利要求1所述的胎盘...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小龙，张雪梅，张志平，闫鹏辉，张君涛，杨海燕，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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