组织因子途径抑制物抗凝活性的检测方法和试剂盒及其应用技术

本发明专利技术公开了组织因子途径抑制物抗凝活性的检测方法和试剂盒及其应用。该检测方法包括(1)混合待测样本和抗人组织因子途径抑制物抗体孵育获得实验样品，混合待测样本和水孵育获得对照样品；(2)向步骤(1)获得的实验样品和对照样品分别加入重组人组织因子酯化物孵育；(3)向完成步骤(2)孵育后的实验样品和对照样品分别加入钙离子溶液；(4)检测完成步骤(3)处理的实验样品和对照样品的吸光度；(5)通过步骤(4)检测得到的吸光度确定待测样本的组织因子途径抑制物抗凝活性；待测样本为乏血小板血浆。本发明专利技术提供的检测方法实时动态监测血浆的吸光度随时间变化的曲线，比较添加与不添加TFPI抗体的曲线差异，计算相关参数代表TFPI抗凝活性能力。凝活性能力。

【技术实现步骤摘要】
组织因子途径抑制物抗凝活性的检测方法和试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及组织因子途径抑制物抗凝活性的检测方法和试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]组织因子是体内凝血的主要引发物，组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是组织因子的唯一生理抑制物。目前尚无已知人类TFPI缺陷的报道，研究表明小鼠完全缺乏TFPI时具有胚胎致死性。为评估人体凝血状态，需要测量内源性TFPI水平。文献指出，TFPI的含量随疾病的发生发展而发生变化。目前临床尚无用于测量内源性TFPI水平的凝血试验。因此，有必要建立灵敏而特异的检测TFPI的方法。
[0003]现有的几种检测TFPI水平的方法，例如基于活化凝血因子X(FXa)发色底物的TFPI功能检测实验和基于酶联免疫吸附实验的TFPI抗原水平检测实验各有利弊，尚未应用于临床。
[0004]基于FXa发色底物的TFPI功能检测实验：1991年Sandset等学者基于TFPI抑制组织因子
‑
活化凝血因子VII(TF
‑
FVIIa)复合物的催化活性的能力将发色底物法应用于检测血浆中TFPI的活性。实验原理具体为(1)通过[TF
‑
FVIIa]复合物对FXa的抑制：TF+FVIIa(excess)+FXa+TFPI(plasma)——[TF
‑
FVIIa
‑
TFPI
‑
FXa]+[TF/>‑
FVIIa residual]；(2)FXa与底物反应导致发色团的释放：[TF
‑
FVIIa]+FX(excess)+S
‑
2222(FXa发色底物)——[TF
‑
FVIIa]+FXa(residual)+肽+生色团；而后用微量滴定板读数器在405m处读取吸光度，表示FXa生成量。血浆中的TFPI活性与FXa生成量呈反比。限制该检测方法的主要问题有两点，其一是文献指出，该方法结果与TFPI总抗原水平呈正相关，无法充分区分截短型TFPI和游离型TFPI，后者虽起主要抗凝作用但在血浆TFPI中占很小比例，其二是TFPI除了与TF/FVIIa和FXa形成四联体复合物外，还具有抑制凝血酶原酶等抗凝功能，在该方法中不能体现。
[0005]基于酶联免疫吸附实验的TFPI抗原水平检测实验：American Diagnostica Inc.、Diagnostica Stago和R&D systems三家公司相继研发基于酶联免疫吸附实验的试剂盒用于检测血浆中总TFPI抗原水平或游离型TFPI抗原水平。TFPI酶联免疫吸附试验和TFPI/Xa复合酶联免疫吸附试验在于其敏感性。除了测量二元和四元TFPI/Xa复合物外，总TFPI抗原水平还包括游离型和截短型的TFPI以及TFPI与TF和FVIIa的复合物。但此检测方法的主要问题在于其检测的是抗原水平，而非功能活性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一在于检测组织因子途径抑制物抗凝活性。
[0007]本专利技术提供了检测组织因子途径抑制物抗凝活性的试剂盒，包括抗人组织因子途径抑制物抗体和重组人组织因子酯化物。
[0008]可选地，根据上述的试剂盒，所述抗人组织因子途径抑制物抗体的浓度为20微克每毫升；所述重组人组织因子酯化物的浓度为25PM。使用时，所述抗人组织因子途径抑制物
抗体的浓度可为4微克每毫升；所述重组人组织因子酯化物的浓度可为5PM。
[0009]可选地，根据上述的试剂盒，还包括钙离子溶液和/或酶标仪。钙离子溶液浓度例如为0.125M，使用时，所述钙离子浓度可为0.025M。
[0010]上述的试剂盒在如下任一中的应用也属于本专利技术的保护范围：
[0011](1)制备检测待测样本中组织因子途径抑制物抗凝活性产品，或检测待测样本中组织因子途径抑制物抗凝活性；
[0012](2)制备判断待测者凝血状态的产品，或判断待测者凝血状态，判断待测者凝血状态例如为预测待测者的深静脉血栓发生，又例如为评估待测者的组织因子途径抑制物的抗凝功能。
[0013]本专利技术还提供了一种用于判断待测者凝血功能的数据处理装置，包括如下模块：
[0014]数据接收模块，所述数据接收模块被配置为接收实验样品和对照样品的组织因子途径抑制物吸光度值变化曲线；
[0015]一阶导数生成模块，所述一阶导数生成模块被配置为接收来自所述接收模块的所述实验样品和对照样品的组织因子途径抑制物吸光度值变化曲线，分别进行曲线拟合获得实验样品和对照样品的一阶导数曲线；
[0016]参数计算模块，所述参数计算模块被配置为接收所述一阶导数生成模块的一阶导数曲线，计算TFPI初始抗凝时间差、TFPI初始抗凝时间比、TFPI整体抗凝时间比、TFPI抗凝活性和TFPI抗凝率，
[0017]所述五种参数如下公式获得：
[0018]所述TFPI初始抗凝时间差＝AB(时间)
‑
DE(时间)，
[0019]所述TFPI初始抗凝时间比＝(AB(时间)
‑
DE(时间))/AB(时间)
×
100，
[0020]所述TFPI整体抗凝时间比＝(AC(时间)
‑
DF(时间))/AC(时间)
×
100，
[0021]所述TFPI抗凝活性＝N值(曲线下面积)
‑
M值(曲线下面积)，
[0022]所述TFPI抗凝率＝[N值(曲线下面积)
‑
M值(曲线下面积)]/M值(曲线下面积)
×
100，
[0023]所述AB为所述对照样品的一阶导数曲线极值点和第一个零点值的差值，所述DE为所述实验样品的一阶导数曲线极值点和第一个零点值的差值，所述AC为所述对照样品的一阶导数曲线第二个零点值和第一个零点值的差值，所述DF为所述实验样品的一阶导数曲线第二个零点值和第一个零点值的差值，所述N值为所述实验样品的一阶导数曲线的曲线下面积，所述M值为所述对照样品的一阶导数曲线的曲线下面积；
[0024]输出模块：所述输出模块被配置为接收由所述参数计算模块所获得的TFPI初始抗凝时间差、TFPI初始抗凝时间比、TFPI整体抗凝时间比、TFPI抗凝活性和TFPI抗凝率的数值，并选择所述参数中的至少一个参数的数值作为待测者血液凝血功能输出。
[0025]本专利技术还提供了一种用于判断待测者凝血状态的数据处理装置，包括如下模块：
[0026]数据接收模块，所述数据接收模块被配置为接收实验样品和对照样品的组织因子途径抑制物吸光度值变化曲线；
[0027]一阶导数生成模块，所述一阶导数生成模块被配置为接收来自所述接收模块的所述实验样品和对照样品的组织因子途径抑制物吸光度值变化曲线，分别进行曲线拟合获得实验样品和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测组织因子途径抑制物抗凝活性的试剂盒，其特征在于：包括抗人组织因子途径抑制物抗体和重组人组织因子酯化物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述抗人组织因子途径抑制物抗体的浓度为20微克每毫升；所述重组人组织因子酯化物的浓度为25PM。3.权利要求1或2所述的试剂盒在如下任一中的应用：(1)制备检测待测样本中组织因子途径抑制物抗凝活性产品，或检测待测样本中组织因子途径抑制物抗凝活性；(2)制备判断待测者凝血状态的产品，或判断待测者凝血状态。4.一种用于判断待测者血液凝血功能的数据处理装置，其特征在于：包括如下模块：数据接收模块，所述数据接收模块被配置为接收实验样品和对照样品的组织因子途径抑制物吸光度值变化曲线；一阶导数生成模块，所述一阶导数生成模块被配置为接收来自所述接收模块的所述实验样品和对照样品的组织因子途径抑制物吸光度值变化曲线，分别进行曲线拟合获得实验样品和对照样品的一阶导数曲线；参数计算模块，所述参数计算模块被配置为接收所述一阶导数生成模块的一阶导数曲线，计算TFPI初始抗凝时间差、TFPI初始抗凝时间比、TFPI整体抗凝时间比、TFPI抗凝活性和TFPI抗凝率，所述参数由如下公式计算获得：所述TFPI初始抗凝时间差＝AB
‑
DE，所述TFPI初始抗凝时间比＝(AB
‑
DE)/AB
×
100，所述TFPI整体抗凝时间比＝(AC
‑
DF)/AC
×
100，所述TFPI抗凝活性＝N值
‑
M值，所述TFPI抗凝率＝(N值
‑
M值)/M值
×
100，所述AB为所述对照样品的一阶导数曲线极值点和第一个零点值的差值，所述DE为所述实验样品的一阶导数曲线极值点和第一个零点值的差值，所述AC为所述对照样品的一阶导数曲线第二个零点值和第一个零点值的差值，所述DF为所述实验样品的一阶导数曲线第二个零点值和第一个零点值的差值，所述N值为所述实验样品的一阶导数曲线的曲线下面积，所述M值为所述对照样品的一阶导数曲线的曲线下面积；输出模块：所述输出模块被配置为接收由所述参数计算模块所获得的TFPI初始抗凝时间差、TFPI初始抗凝时间比、TFPI整体抗凝时间比、TFPI抗凝活性和TFPI抗凝率的数值，并选择所述参数中的至少一个参数的数值作为待测者血液凝血功能输出。5.一种用于判断待测者凝血状态的数据处理装置，其特征在于：包括如下模块：数据接收模块，所述数据接收模块被配置为接收实验样品和对照样品的组织因子途径抑制物吸光度值变化曲线；一阶导数生成模块，所述一阶导数生成模块被配置为接收来自所述接收模块的所述实验样品和对照样品的吸光度值变化曲线，分别进行曲线拟合获得实验样品和对照样品的一阶导数曲线；参数计算模块，所述参数计算模块被配置为接收所述一阶导数生成模块的一阶导数曲线，计算TFPI初始抗凝时间差、TFPI初始抗凝时间比、TFPI整体抗凝时间比、TFPI抗凝活性
和TFPI抗凝率中的至少一种参数，所述参数由如下公式计算获得：所述TFPI初始抗凝时间差＝AB

【专利技术属性】
技术研发人员：吴俊，曹翔宇，
申请(专利权)人：北京积水潭医院，
类型：发明
国别省市：