一种基于流式细胞术的免涂板操作的菌株工程改造的方法及应用技术

本发明专利技术构建了一种基于流式细胞术的免平板操作的菌株工程改造的方法，将将带有选择性标记基因的DNA序列的转化进入目的真菌原生质体基因组中、流式细胞仪分选、深孔板培养、以及表型快速分析步骤结合起来。可直接用于丝状真菌遗传转化后的原生质体的筛选和分离，解决了现有丝状真菌技术中铺平板培养、转化子挑选、分生孢子制备以及摇瓶鉴定过程中耗时长、费力、通量低的瓶颈问题。本发明专利技术的方法操作方便、省时省力，极大提高丝状真菌工程改造的效率，可便捷有效的进行高通量构建丝状真菌高产工程菌。程菌。

【技术实现步骤摘要】
一种基于流式细胞术的免涂板操作的菌株工程改造的方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程和生物
，具体地，涉及一种基于流式细胞术的免平板操作的菌株工程改造方法的构建及其应用。

技术介绍

[0002]丝状真菌工业性状改良的高产菌株主要是通过基因工程技术进行的。但是传统的丝状真菌菌株改造技术是非常复杂和繁琐的，其中包括菌株遗传转化，转化后倒平板、原生质体的平板培养、从选择平板中挑取转化子到固体平板上、培养用于孢子形成的菌落、收集转化子的分生孢子用于后续的PCR验证和用于表型分析的摇瓶培养（现有的工程改造过程如图7所示）。因此，需要大量复杂的人工操作来进行倒平板、从培养板中挑选单个转化子到固体平板中进行分离培养、收集洗涤转化子的分生孢子、以及接种分生孢子到三角摇瓶进行振荡培养，这些操作过程繁杂极其耗时费力且费用大，严重限制了丝状真菌的工业生产菌株选育。
[0003]近年来，虽然在里氏木霉中构建了基于流式细胞仪分选的高通量筛选技术，但是这些技术仍然需要进行常规的遗传转化和转化后倒平板的操作，包括将转化的原生质体铺到再生培养平板中，从选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于流式细胞术的免平板操作的丝状真菌工程改造的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将带有筛选标记，例如选择性标记基因或者带有营养缺陷型基因，和目标DNA序列的转化进入目的真菌原生质体基因组中；（2）转化后获得的原生质体在含相应于所述选择性标记基因的选择性物质的培养液中进行再生和萌发培养，所述再生和萌发培养是指培养至用于后续筛选的短菌丝形态的转化子，优选地所述短菌丝形态是指不超过70 μm的短菌丝体，具体地培养8
‑
16小时的短菌丝形态的转化子；（3）利用流式细胞仪检测步骤（2）获得的转化子直接分选至孔板中进行发酵培养，优选地，所述孔板是具有高通量筛选作用的培养器皿；（4）分析检测步骤（3）中分选到孔板发酵培养的转化子，离心后取出孔板中上清液进行蛋白测定，比较分泌目标蛋白的相对高低，得到基因工程成功改造的突变菌株；任选地，还包括下述步骤：（5）选取上一步得到的突变菌株进行摇瓶复筛，并对选取目标蛋白产量高的突变菌株用步骤（1
−
4）所述的方法再次进行工程改造。2.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述丝状真菌包括但不限于毁丝霉属（Myceliophthora）、曲霉属（Aspergillus）、梭孢壳霉属（Thielavia）、脉孢菌（Neurospora）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）、或根霉属（Rhizopus）中的任意一种，更优选为毁丝霉属（Myceliophthora）和曲霉属（Aspergillus），最优选为嗜热毁丝霉或黑曲霉。3.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述第（3）步所述分选，是每孔分选设定为单个至十个转化子，例如每孔分选设定为单个、双个或三个转化子；所述的深孔板是96深孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板；优选地，所述流式细胞仪检测步骤（2）获得的转化子直接分选至深孔板具体是将转化子的悬液经（例如≤70μm孔径白色细胞）筛网过滤后上流式细胞仪进行分析，通过调节优化FSC、SSC、FL1
‑
log
‑
Height参数正确区分再生萌发出芽且目的蛋白成功表达的转化子分选至装有液体培养基的高通量孔板中；优选地，所述选择性标记基因是指遗传转化过程中用来筛选转化子细胞的基因，更具体地，包括（但并不限于）：潮霉素抗性基因（hph）、氯嘧璜隆（sur）、G418抗性基因（neo）、草丁膦抗性基因（bar）；所述营养缺陷型基因是指指遗传转化过程中用来筛选转化子细胞的基因，更具体地，包括（但并不限于）：尿嘧啶缺陷基因（pyrG）、色氨酸缺陷基因（trp）...

【专利技术属性】
技术研发人员：田朝光，王兴吉，刘倩，杨玉净，刘音，刘丹丹，郭文柱，孙涛，孙文良，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：