多种抗病基因及其基因组堆叠件制造技术

领域为分子生物学，并且更特别地，用于使用位点特异性编辑在基因组基因座中对多种天然基因、如抗病基因进行染色体工程化以产生植物的方法。本文还描述了在植物中产生包含多个种内多核苷酸序列的异源基因组基因座的方法。种内多核苷酸序列的异源基因组基因座的方法。种内多核苷酸序列的异源基因组基因座的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多种抗病基因及其基因组堆叠件
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2021年3月1日提交的美国临时申请号63/154,960和2020年8月18日提交的美国临时申请号63/067,090的权益，将其中的每一个通过引用以其全文并入本文。


[0003]领域为分子生物学，并且更特别地，用于使用位点特异性编辑在基因组基因座中对多种天然基因、如抗病基因进行染色体工程化以产生植物的方法。
[0004]以电子方式递交的序列表的引用
[0005]序列表的官方副本经由EFS
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Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“7823WO ST25.txt”，创建于2021年8月10日，且具有249千字节大小，并与本说明书同时提交。包含在此ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其全文并入本文。

技术介绍

[0006]植物在其染色体中含有多个基因及其等位基因变体。但是那些基因和等位基因通常不会以促进更快育种的方式与其他性状(如昆虫抗性和除草剂耐受性)结合。例如，对多种疾病的抗性是作物改良的重要组成部分，特别是在疾病压力和模式在不断变化的气候下迅速演变时。对特定疾病的抗性典型地通过将基因组区从抗性来源渗入至优良品系来实现。此方法耗时且经常导致产量累赘以及其他有害影响。此外，赋予针对多种疾病的抗性的渗入基因座变得不切实际(在时间和资源的背景下)(因为涉及的基因座数量)并且在遗传连锁基因座的情况下变得很困难。本公开提供了多种方法和组合物来克服使用多个基因座进行育种中的一些困难，并且提供了用于染色体工程化基因堆叠件如例如抗病基因的平台。

技术实现思路

[0007]可以通过本文所述的组合物和方法来克服用于将基因组区从来源渗入至优良品系的常规育种的限制。
[0008]本文提供的实施例描述了用于定义作物基因组区的方法，该作物基因组被特异性工程化以赋予对多种疾病、病原体种族及其组合的抗病性。另外，本文公开了用于通过基因编辑插入多种抗病基因并在定义的区内组合这些基因的方法。此外，本文公开了用于结合产品环境中的其他性状部署工程化区域的方法。
[0009]本文提供了用于在作物植物细胞中产生非天然的异源基因组基因座的方法，该异源基因组基因座包含多个种内多核苷酸序列。这些方法包括将两个或更多个种内多核苷酸序列引入植物细胞中的预定基因组基因座中，其中引入步骤不会导致对植物来说是天然的转基因或外源多核苷酸的整合；种内多核苷酸赋予植物一个或多个农艺学特征；在种内多核苷酸整合至异源基因组基因座之前，这些种内多核苷酸中的至少一个或多个来自不同的
染色体，或者与异源基因组基因座相比，这些种内多核苷酸不位于与其天然配置相同的染色体中；并且该引入步骤包括不是传统育种的至少一种位点定向基因组修饰。在一个实施例中，该基因组基因座与包含一种或多种转基因性状的基因组基因座相邻，这些转基因性状包含来自不同植物物种的多个多核苷酸。在另一实施例中，转基因性状包含赋予对一种或多种昆虫的抗性的一种或多种性状。在又一实施例中，转基因性状包含除草剂耐受性状。
[0010]在一个实施例中，基因组基因座由约1至约5cM或作物植物物种的等效物理染色体图谱距离的染色体区定义。在另一实施例中，染色体区为约10Kb至约50Mb。在一些方面，该植物为玉米、大豆、卡诺拉油菜或棉花植物。
[0011]还提供了在优良作物植物基因组中产生疾病超级基因座(disease super locus)以提高该优良作物植物中的性状渗入效率的方法，该方法包括通过以下来在该作物植物染色体的预定基因组基因座处引入多种抗病性状：工程化插入两个或更多个抗病基因、通过靶向染色体工程化来基因组易位一个或多个抗病基因、通过靶向基因组修饰在该基因组基因座处工程化复制一个或多个抗病基因、通过引入一个或多个插入来修饰该基因组基因座、缺失或取代该基因组中的核苷酸、或上述的组合。在一个实施例中，疾病超级基因座与转基因性状连锁不平衡。在另一实施例中，转基因性状选自由昆虫抗性、除草剂耐受性和农艺学性状组成的组。在又一实施例中，转基因性状为先前存在的商业性状。在另一实施例中，通过减少至少50％回交或减少三代回交来提高性状渗入效率。在另一实施例中，通过减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％回交来提高性状渗入效率。在又一实施例中，通过减少至少一代、二代、三代或四代回交来提高性状渗入效率。
[0012]还提供了用于获得具有经修饰的基因组基因座的植物细胞的方法，该经修饰的基因组基因座包含至少两个异源多核苷酸序列或至少两种性状，该至少两个异源多核苷酸序列赋予对至少一种植物疾病的增强的抗病性，该至少两种性状通过两种不同的作用模式导致对至少一种疾病的抗性，其中所述至少两个多核苷酸序列与相应的基因组基因座异源并且来自相同的植物物种。该方法包括在植物细胞的基因组基因座的至少一个靶位点处引入位点特异性修饰；将赋予增强的抗病性的至少两个多核苷酸序列引入靶位点；以及获得具有基因组基因座的植物细胞，该基因组基因座包含赋予增强的抗病性的至少两个多核苷酸序列。在一个实施例中，至少一个靶位点包含选自表2的靶位点。在另一实施例中，两个异源多核苷酸中的至少一个进一步包含位点特异性修饰。在又一实施例中，位点特异性修饰为遗传修饰或表观遗传修饰。在一个实施例中，多核苷酸序列编码多肽序列，其中该多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少90％同一性：RppK(SEQ ID NO：11)、Ht1(SEQ ID NO：8)、NLB18(SEQ ID NO：3或5)、NLR01(SEQ ID No：29)、NLR02(SEQ ID No：26)、RCG1(SEQ ID No：31)、和RCG1b(SEQ ID No：33)。在另一实施例中，多核苷酸序列编码多肽序列，其中该多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性：RppK(SEQ ID NO：11)、Ht1(SEQ ID NO：8)、NLB18(SEQ ID NO：3或5)、NLR01(SEQ ID No：29)、NLR02(SEQ ID No：26)、RCG1(SEQ ID No：31)、和RCG1b(SEQ ID No：33)。在又一实施例中，多核苷酸序列编码多肽序列，其中该多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少90％同一性：PRR03(SEQ ID No：36)、PRR01(SEQ ID No：38)、NLR01(SEQ ID No：41)、和NLR04(SEQ ID No：44)。在另一实施例中，多核苷酸序列编码多肽序列，其中该多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性：PRR03(SEQ ID No：36)、PRR01(SEQ ID No：38)、NLR01(SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在作物植物细胞中产生包含多个种内多核苷酸序列的异源基因组基因座的方法，所述方法包括将两个或更多个种内多核苷酸序列引入所述植物细胞中预定的异源基因组基因座，其中(a)引入步骤不会导致对所述植物来说不是天然的转基因或外源多核苷酸的整合；(b)所述种内多核苷酸赋予所述植物一种或多种农艺学特征；(c)在所述种内多核苷酸整合至所述异源基因组基因座之前，所述种内多核苷酸中的至少一个或多个来自不同的染色体，或者与所述异源基因组基因座相比，所述种内多核苷酸不位于与其天然配置相同的染色体中；并且(d)所述引入步骤包括不是传统育种的至少一种定点基因组修饰。2.如权利要求1所述的方法，其中所述基因组基因座与包含一种或多种转基因性状的基因组基因座相邻，所述转基因性状包含不是来自相同植物物种的多个多核苷酸。3.如权利要求2所述的方法，其中所述转基因性状包含赋予对一种或多种昆虫的抗性的一种或多种性状。4.如权利要求2所述的方法，其中所述转基因性状包含除草剂耐受性状。5.如权利要求1所述的方法，其中所述基因组基因座由约1至约5cM或作物植物物种的等效物理染色体图谱距离的染色体区定义。6.如权利要求5所述的方法，其中所述染色体区为约10Kb至约50Mb。7.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸序列包含基因的至少两个等位基因。8.如权利要求1所述的方法，其中所述植物为玉米、大豆、卡诺拉油菜或棉花植物。9.一种在优良作物植物基因组中产生疾病超级基因座以提高所述优良作物植物中的性状渗入效率的方法，所述方法包括通过以下的工程化来在所述作物植物染色体的预定基因组基因座处引入多种抗病性状：(a)插入两个或更多个抗病基因、(b)通过靶向染色体工程化来基因组易位一个或多个抗病基因、(c)通过靶向基因组修饰在所述基因组基因座处复制一个或多个抗病基因、(d)通过引入一个或多个插入来修饰所述基因组基因座、(e)缺失或取代所述基因组中的核苷酸、或上述的组合。10.如权利要求9所述的方法，其中所述疾病超级基因座与转基因性状存在连锁不平衡。11.如权利要求10所述的方法，其中所述转基因性状选自由昆虫抗性、除草剂耐受性和农艺学性状组成的组。12.如权利要求10所述的方法，其中所述转基因性状为先前存在的商业性状。13.如权利要求9所述的方法，其中通过减少至少50％回交或减少至少两代或三代回交来提高所述性状渗入效率。14.如权利要求9所述的方法，其中所述植物为玉米、大豆、卡诺拉油菜或棉花植物。15.一种用于获得具有经修饰的基因组基因座的植物细胞的方法，所述经修饰的基因组基因座包含至少两个异源多核苷酸序列或至少两种性状，所述至少两个异源多核苷酸序列赋予对至少一种植物疾病的增强的抗病性，所述至少两种性状通过两种不同的作用模式导致对至少一种疾病的抗性，其中所述至少两个多核苷酸序列与相应的基因组基因座异源并且来自相同的植物物种，所述方法包括：a.在植物细胞的基因组基因座的至少一个靶位点处引入位点特异性修饰；
b.将赋予增强的抗病性的至少两个多核苷酸序列引入所述靶位点；以及c.获得具有基因组基因座的植物细胞，所述基因组基因座包含赋予增强的抗病性的至少两个多核苷酸序列。16.如权利要求15所述的方法，其中所述至少一个靶位点包含选自表2的靶位点。17.如权利要求15所述的方法，其中所述两个异源多核苷酸中的至少一个进一步包含位点特异性修饰。18.如权利要求17所述的方法，其中所述位点特异性修饰是遗传修饰或表观遗传修饰。19.如权利要求15所述的方法，其中所述多核苷酸序列编码赋予增强的抗病性的多肽序列。20.如权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸序列编码赋予增强的抗病性的多肽序列，其中所述多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少90％同一性：RppK(SEQ ID NO：11)、Htl(SEQ ID NO：8)、NLB18(SEQ ID NO：3或5)、NLR01(SEQ IDNo：29)、NLR02(SEQ ID No：26)、RCG1(SEQ ID No：31)、和RCG1b(SEQ ID No：33)。21.如权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸序列编码赋予增强的抗病性的多肽序列，其中所述多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少90％同一性：PRR03(SEQ ID No：36)、PRR01(SEQ ID No：38)、NLR01(SEQ ID No：41)、和NLR04(SEQ ID No：44)。22.如权利要求15所述的方法，其中所述至少两个多核苷酸序列包含非编码RNA或dsRNA。23.如权利要求15所述的方法，其中所述植物为玉米、大豆、卡诺拉油菜或棉花植物。24.一种用于获得具有经修饰的基因组基因座的植物细胞的方法，所述经修饰的基因组基因座包含至少两个多核苷酸序列或至少两种性状，所述至少两个多核苷酸序列赋予对至少一种植物疾病的增强的抗病性，所述至少两种性状通过两种不同的作用模式导致对至少一种疾病的抗性，其中所述至少两个多核苷酸序列与相应的基因组基因座异源，所述方法包括：a.在植物细胞的基因组基因座的一个或多个靶位点处引入双链断链或位点特异性修饰；b.引入赋予增强的抗病性的至少两个多核苷酸序列；以及c.获得具有基因组基因座的植物细胞，所述基因组基因座包含赋予增强的抗病性的至少两个多核苷酸序列。25.如权利要求24所的方法，其中所述至少一个靶位点包含选自表2的靶位点。26.如权利要求24所述的方法，其中所述多核苷酸序列编码赋予增强的抗病性的多肽序列。27.如权利要求26所述的方法，其中所述多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少90％同一性：RppK(SEQ ID NO：11)、Htl(SEQ ID NO：8)、NLB18(SEQ ID NO：3或5)、NLR01(SEQ ID No：29)、NLR02(SEQ ID No：26)、RCG1(SEQ ID No：31)、和RCG1b(SEQ ID No：33)。28.如权利要求26所述的方法，其中所述多肽序列与选自由以下组成的组的多肽序列具有至少90％同一性：PRR03(SEQ ID No：36)、PRR01(SEQ ID No：38)、NLR01(SEQ ID No：41)、和NLR04(SEQ ID No：44)。
29.如权利要求24所述的方法，其中所述植物为玉米、大豆、卡诺拉油菜或棉花植物...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：