一种细胞穿膜肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞穿膜肽及其应用。所述细胞穿膜肽命名为细胞穿膜肽GAN_839K，氨基酸序列为RLWRIWHQNRRMRYRK。本发明专利技术所述的细胞穿透肽能够穿透多种类型细胞的细胞膜进入细胞，同时有递送蛋白质进入细胞的功能，并且对细胞没有毒性。本发明专利技术所述的小肽可用于药物递送系统的开发和纳米材料的制备等。送系统的开发和纳米材料的制备等。送系统的开发和纳米材料的制备等。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞穿膜肽及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种细胞穿膜肽及其应用。

技术介绍

[0002]由于细胞膜的屏障作用，多种具有治疗功效的蛋白质、多肽和寡聚核苷酸难以进入细胞发挥药效。
[0003]细胞穿膜肽(cell
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penetrating peptides，CPPs)是由大约8
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30个氨基酸残基组成的寡肽，能够被活细胞吸收。将不容易进入细胞的蛋白质、多肽和寡聚核苷酸药物通过与细胞穿膜肽偶联，然后由细胞穿膜肽带入细胞内，从而发挥蛋白质、多肽和寡聚核苷酸药物在细胞内的功能。
[0004]现有不同类型的CPPs，包括阳离子肽、两亲肽(阳离子/疏水)和疏水肽(疏水＞阳离子)，其中阳离子氨基酸(如精氨酸和赖氨酸)起着关键作用。
[0005]比如，公开号为CN108707187A的专利技术公开了一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用，所述细胞穿膜肽包括第一序列RRRRRKQARRPRRRRAR，或包含第二序列RSSRRRRRRRRRKQRKVKR。
[0006]再比如，公开号为CN108059655A的专利技术公开了一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用，所述细胞穿膜肽包括如下序列：PGRKRRRRRRKG。且所述细胞穿膜肽安全，穿膜效果显著。
[0007]两亲肽CPPs通常采用螺旋结构，在阳离子部分和疏水部分之间有明显的分离，其稳定的螺旋结构是有效细胞膜通透性的关键。CPPs可以将不透膜的化合物、蛋白质和核酸输送到活细胞中；因此，它们有望用作药物输送工具。高效且毒性可忽略的新型CPPs仍在开发中(Oba M.Cell
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Penetrating Peptide Foldamers：Drug
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Delivery Tools.Chembiochem.2019Aug 16；20(16)：2041
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2045.doi：10.1002/cbic.201900204.Epub 2019Jul9.PMID：30997711.)。

技术实现思路

[0008]本专利技术研究发现了一种新的细胞穿膜肽，能够高效进入贴壁细胞、悬浮细胞、CD8
+
T细胞等各类细胞。
[0009]一种细胞穿膜肽，命名为细胞穿膜肽GAN_839K，氨基酸序列为RLWRIWHQNRRMRYRK。
[0010]优选的，所述细胞穿膜肽，在细胞穿膜肽GAN_839K的C端加入马来酰亚胺修饰。C端修饰了马来酰亚胺后，可以直接与C端有半胱氨酸残基的蛋白质或多肽等通过马来酰亚胺与巯基的迈克尔加成反应进行偶联。
[0011]本专利技术还提供了所述细胞穿膜肽在制备用于将外源蛋白质递送到细胞内的递送系统中的应用。所述的应用，将所述细胞穿膜肽与待递送的外源蛋白质偶联。所述细胞穿膜肽能够将外源蛋白质递送到包括但不限于贴壁细胞、悬浮细胞、CD8
+
T细胞内。
[0012]多肽和蛋白质或其他多肽之间的偶联可以有多种不同的方式，由于细胞穿膜肽负责将偶联物带入到细胞内，然后由偶联的另一半来发挥细胞内的功能，所以，只要能够将两
者偶联在一起即可，偶联的方式并没有特别限制。
[0013]优选的，偶联时，在所述细胞穿膜肽的C端加入马来酰亚胺修饰，在外源蛋白质的C端表达有半胱氨酸，通过马来酰亚胺与巯基的迈克尔加成反应将所述细胞穿膜肽与外源蛋白质偶联。优选时，偶联时，所述细胞穿膜肽与外源蛋白质的摩尔比为6∶1。在该比例下，本专利技术细胞穿膜肽具有较好的偶联效果。优选的，偶联时，在室温下进行。偶联反应时间不少于2小时。偶联后对产物进行透析去除未偶联成功的细胞穿膜肽。
[0014]本专利技术所述的细胞穿透肽能够穿透细胞膜进入细胞，同时有递送蛋白质进入细胞的功能，并且对细胞没有毒性。本专利技术所述的小肽可用于药物递送系统的开发和纳米材料的制备等。
附图说明
[0015]图1为GAN_839K多肽的螺旋轮结构示意图，蓝色为带有阳离子的氨基酸残基。
[0016]图2为GAN_839K多肽的三维结构示意图，其中蓝色部分是N端，橙色部分是C端。
[0017]图3为GAN_839K多肽与EGFP蛋白通过麦克尔加成方法偶联的示意图，其中，“HA”表示EGFP的C端连接一个HA标签，“C”表示半胱氨酸残基，“Mal”表示在CPP(这里是GAN_839K多肽)的C端修饰了马来酰亚胺。
[0018]图4为EGFP蛋白的质粒图谱。
[0019]图5为GAN_839K多肽在贴壁细胞中的穿膜实验验证流式分析结果图。灰色为GAN_839K多肽的流式结果；黑色为阳性对照(阳离子肽9R)的流式结果，****表示p＜0.0001。
[0020]图6为GAN_839K多肽在贴壁细胞中的穿膜实验验证荧光结果图，其中，A为GAN_839K多肽与EGFP偶联产物；B为未偶联GAN_839K多肽的EGFP。
[0021]图7为GAN_839K多肽在悬浮细胞中的穿膜实验验证流式分析结果图。灰色为GAN_839K多肽的流式结果；黑色为阳性对照(阳离子肽9R)的流式结果，****表示p＜0.0001。
[0022]图8为GAN_839K多肽在悬浮细胞中的穿膜实验验证荧光结果图，其中，A为GAN_839K多肽与EGFP偶联产物；B为未偶联GAN_839K多肽的EGFP。
[0023]图9为GAN_839K多肽在CD8+T细胞中的穿膜实验验证流式分析结果图。灰色为GAN_839K多肽的流式结果；黑色为阳性对照(阳离子肽9R)的流式结果，****表示p＜0.0001。
[0024]图10为GAN_839K多肽在CD8+T细胞中的穿膜实验验证荧光结果图，其中，A为GAN_839K多肽与EGFP偶联产物；B为未偶联GAN_839K多肽的EGFP。
[0025]图11为GAN_839K多肽在HEK 293T细胞内的CCK
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8毒性检测结果。
[0026]图12为GAN_839K多肽在HeLa细胞内的CCK
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8毒性检测结果。
[0027]图13为GAN_839K多肽在U87细胞内的CCK
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8毒性检测结果。
[0028]图14为GAN_839K多肽在HepG2细胞内的CCK
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8毒性检测结果。
[0029]图15为GAN_839K多肽在Jurkat细胞内的CCK
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8毒性检测结果。
[0030]图16为GAN_839K多肽在K562细胞内的CCK
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8毒性检测结果。
[0031]图17为GAN_839K多肽在THP1细胞内的CCK
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8毒性检测结果。
[0032]图18为GAN_839K多肽在CD8+T细胞内的CCK
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8毒性检测结果。
具体实施方式
[0033]实施例1：细胞穿膜肽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞穿膜肽，其特征在于，命名为细胞穿膜肽GAN 839K，氨基酸序列为RLWRIWHQNRRMRYRK。2.根据权利要求1所述细胞穿膜肽，其特征在于，在细胞穿膜肽GAN 474的C端加入马来酰亚胺修饰。3.权利要求1或2所述细胞穿膜肽在制备用于将外源蛋白质递送到细胞内的递送系统中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述细胞穿膜肽与待递送的外源蛋白质偶联。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，偶联时，在所述细胞穿膜肽的C端...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚远，周宇乔，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：