一种基于人工智能设计的抗菌肽yuce4及其突变体制造技术

本发明专利技术基于深度学习和分子动力学模拟设计，得到了一种基于人工智能设计的全新序列的抗菌肽yuce 4，具有高效广谱的抗菌作用。本发明专利技术通过核磁共振解析(NMR)、圆二色谱(CD)和Alphafold2三维结构预测，都证明了yuce 4的α螺旋的存在。本发明专利技术还设计了yuce 4的突变体，发现对嗜麦芽窄食单胞菌WH006和铜绿假单胞菌PAO1的活性可以提高4

【技术实现步骤摘要】
一种基于人工智能设计的抗菌肽yuce 4及其突变体


[0001]本专利技术属于抗菌药物
，具体涉及抗菌肽及其突变体在抑制细菌生长中的应用。

技术介绍

[0002]抗生素是临床上用于治疗细菌感染疾病最常见的药物。但随着近些年抗生素的滥用，越来越多的耐药性细菌随之诞生，成为人类健康与安全的最大威胁之一，开发新的抗菌药物已经刻不容缓。在药物的开发和设计过程，传统方法往往面临消耗时间长、成本高、容错率低等问题，而人工智能(Artificial intelligence,AI)够在短期内收集药物分子信息，组合构建一个样本大的数据库，利用机器学习它们的结构或物理化学特征、成药规律、细胞毒性等特性来给定分子的特性，从而生成一些新的药物分子，然后将其用于候选筛选，实现加速药物设计过程，从而降低成本。
[0003]现有的抗菌药物部分来源于微生物的代谢产物，在这其中抗菌肽由于具有毒性低、抗菌广谱性好、而且不易产生(甚至可能逆转)耐药性等特点引起了人们的广泛关注。经过数十亿年的进化，抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)
[0004]往往作为免疫系统的一部分出现在生物体内，并通过多种作用机制作为防御系统抵御入侵的病原体，发挥着抗菌作用。抗菌肽的分子量小，大多由6到50个氨基酸组成，由于存在数目较多的赖氨酸和精氨酸残基，净电荷数介于+2～+9之间。大多数抗菌肽能够作用于细胞膜，形成跨膜的离子通道，从而破坏细胞膜的完整性使得细菌细胞内容物流出而死亡。已有证据表明，抗菌肽的生物活性与正电荷、疏水性、两亲性和二级结构等因素显著相关，这为抗菌肽的进一步改造提供了切实可行的依据。由于广谱抗菌活性以及低毒性使得抗菌肽代替抗生素来治疗细菌性疾病成为一种方案，具有良好的开发和应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决现有抗生物的不足之处，基于深度学习和分子动力学模拟设计，得到了一种基于人工智能设计的全新序列的抗菌肽yuce 4，具有高效广谱的抗菌作用。
[0006]本专利技术的第一目的，提供了一种基于人工智能设计的抗菌肽yuce 4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]为了进一步提高抗菌肽yuce 4的生物活性，本专利技术的第二目的，还提供了基于抗菌肽yuce 4改造后的突变体，在SEQ ID NO.1的基础上存在如下一个或多个氨基酸突变：D1A，T2A，F3A，G4A，R5A，R7A，R8A，W9A，W10A，L13A，G14A，R17A，R18A，D1R，T2R，F3R，G4R，W9R，W10R，A11R，A12R，L13R，G14R，A15R。
[0008]优选地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2
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36任一所示。
[0009]本专利技术还提供了抗菌肽yuce 4及其突变体的化学制备方法，包括如下步骤：根据yuce 4及其突变体的氨基酸序列，采用多肽固相合成法合成全序列，两个半胱氨酸上的巯基采用ACM保护基进行保护，最后用碘氧化的方法使得二硫键连接；通过C
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反向色谱柱进行
纯化，使用电喷雾质谱进行分子量的测定，用高效液相色谱鉴定纯度和圆二色谱表征二级结构。
[0010]本专利技术的第三目的，提供了所述抗菌肽yuce 4及其突变体在在抑制细菌生长中的应用。
[0011]进一步地，所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
[0012]进一步地，所述革兰氏阴性菌包括产酶溶杆菌YC36、大肠杆菌ATCC8739、嗜麦芽窄食单胞菌WH006、铜绿假单胞菌PAO1、铜绿假单胞菌SM45；所述革兰氏阳性菌包括枯草芽孢杆菌168、苏云金芽孢杆菌BNCC 336393、金黄色葡萄球菌SYZX101。
[0013]优选地，抗菌肽yuce 4突变体在抑制嗜麦芽窄食单胞菌WH006和铜绿假单胞菌PAO1的应用。
[0014]本专利技术的有益效果：
[0015]本专利技术的优点是通过深度学习生成一种全新序列的抗菌肽，经过Alphafold 2和分子动力学模拟进行初步预测其存在α螺旋并且具有预定的稳定性，后又通过核磁共振技术确定了α螺旋存在。它具有显著的广谱抑菌作用，在yuce 4的基础上进行定点突变，发现其突变体的活性又得到了大幅度提升，针对革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的生长都有较强的抑制效果，特别是yuce 4突变体对嗜麦芽窄食单胞菌WH006和铜绿假单胞菌PAO1的活性可以提高4
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8倍。为进一步研发新型抗菌药物，取代原有的抗生素提供了一种新的方案。
附图说明
[0016]图1是由Alphafold 2预测抗菌肽yuce 4的二级结构；
[0017]图2是核磁共振技术解析得到抗菌肽yuce 4的二级结构；
[0018]图3是yuce 4的圆二色谱表征结果；
具体实施方式
[0019]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0020]实施例1:基于人工智能技术抗菌肽的生成及预测
[0021]利用现有的抗菌肽数据库训练抗菌肽生成模型，生成候选抗菌肽，再使用在线网站CAMP再次对候选抗菌肽进行筛选和预测，得到了五条可能性最高的抗菌肽，其序列如表1所示。
[0022]表1抗菌肽的生成及预测
[0023][0024]a:表中所示的抗菌肽骨架分子内的两个半胱氨酸形成了二硫键
[0025]实施例2：alphafold 2预测所生成抗菌肽的二级结构
[0026]通过alphafold 2对五条抗菌肽进行二级结构的预测，结果表明均有α螺旋存在的可能性，其中生成yuce 4的二级结构模型如图1所示。
[0027]实施例3：抗菌肽的化学合成
[0028]实验所用的抗菌肽均采用固相Fmoc化学合成，除需要用到各种带保护基的氨基酸外，所需要的其他原料有RinkAmide树脂、哌啶、DMF、DCM、HCTU、DIPEA、三氟乙酸、三异丙基硅烷、无水乙醚等。多肽合成的方向由C末端到N末端、C端酰胺化修饰。
[0029]具体实施步骤：首先将RinkAmide树脂置于DMF:DCM＝1:1的溶液中溶胀过夜，之后加入20％哌啶溶液反应30min，脱去树脂上的Fmoc保护基。随后按照所需要合成的氨基酸序列依次加入正确的氨基酸，氨基酸偶联时采用DMF作为溶剂，HTCU与DIPEA分别起着缩合剂和活化氨基酸的作用，反应时间为1h。随后再进行氨基酸上Fmoc保护基的脱除，偶联下一个位置的氨基酸，循环往复，直到最后一个氨基酸。多肽序列合成完成后，使用三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝9:0.5:0.5的裂解液反应3h将多肽从树脂上切割下来，后使用乙醚将我们合成的抗菌肽沉淀下来，将肽溶解在浓度为1mg/mL的碘溶液中来氧化Acm保护的半胱氨酸，反应30分钟。然后加入抗坏血酸以终止氧化反应，再用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于人工智能设计得到的抗菌肽yuce 4，其特征在于，所述抗菌肽yuce 4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种抗菌肽yuce 4的突变体，其特征在于，所述突变体在SEQ ID NO.1的基础上存在如下一个或多个氨基酸突变：D1A，T2A，F3A，G4A，R5A，R7A，R8A，W9A，W10A，L13A，G14A，R17A，R18A，D1R，T2R，F3R，G4R，W9R，W10R，A11R，A12R，L13R，G14R，A15R。3.根据权利要求2所述一种抗菌肽yuce 4的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2
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36任一所示。4.一种权利要求1所述抗菌肽yuce 4，或权利要求2或3所述突变体的化学制备方法，其特征在于，包括如下步骤：根据yuce 4及其突变体的氨基酸序列，采用多肽固相...

【专利技术属性】
技术研发人员：于日磊，曹秋实，葛成，王岩，魏志强，杨金波，王雪洁，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：