一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法，垫状青霉(Penicillium pulvillorum)EJ2

【技术实现步骤摘要】
一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法
(一)

[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉一种微生物酶解技术在提取枇杷叶总黄酮中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]枇杷(Eriobotrya japonica)，又名卢桔、卢橘、金丸，为蔷薇科常绿小型乔木，在我国大部分地区均有分布，主产于福建、浙江、江苏、湖北等地。枇杷果实是一种颇受人喜爱的水果，近年来全国种植枇杷的面积逐渐扩大，枇杷的花、叶、果核及果梗均可入药。历版《中华人民共和国药典》一部中的药材均收载了枇杷叶，枇杷叶性味苦，微寒，归肺、胃经。具清肺止咳，降逆止呕的功能，主治肺热咳嗽，气逆喘急，胃热呕逆，烦热口渴。中成药枇杷叶膏是枇杷叶沸水煎煮后浓缩的浸膏，用于治疗肺热燥咳，痰少咽干。近年来，国内外对枇杷叶的化学成分和药理作用研究较多，其主要含有挥发油、三萜类、倍半萜类、黄酮类、多酚类和多糖类等化合物。在枇杷叶的众多化学成分中，黄酮类化合物具有突出的生物活性，在抗氧化、抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂等药用保健方面有显著功能。我国枇杷树种植面积大，每年修剪产生大量废弃叶片，从枇杷叶中提取黄酮，应用于药物、功能食品和饲料等具有良好的经济意义。
[0003]植物总黄酮的提取方法主要有水提取法、碱水提取法、有机溶剂提取法和CO2超临界提取法等，在前3种方法的基础上，又有辅以超声波、高压、微波和酶解等强化提取的方法。不同提取方法有各自的优缺点，如水提取法成本低，但总黄酮得率也较低，提取物中含有大量的多糖和蛋白质；有机溶剂提取法常用乙醇提取，优点是提取得率较高，但乙醇的消耗量较大；超声或微波辅助提取法在水提或乙醇提取法的基础上，增加超声或微波处理，促进黄酮溶出，提取得率有一定的提高；CO2超临界萃取法提取的总黄酮纯度较高，但提取得率往往不高，而且设备要求比较高。目前应用最多的方法是超声辅助乙醇提取法，总黄酮的提取得率和纯度较高，乙醇可以回收重复利用，超声波的使用成本也较低。
[0004]近年来，酶解辅助植物有效成分的提取有较多的应用，它是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等预处理植物原料，可使植物细胞壁成分(纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质等)水解，有利于有效成分在提取时释放，从而提高产物的提取得率。用酶解辅助枇杷叶总黄酮提取也有研究报道，如来丽丽等用纤维素酶辅助提取枇杷叶总黄酮，得率较普通提取法提高了3.5倍[来丽丽,杨荣兵,王桢煜,等.纤维素酶辅助提取枇杷叶总黄酮的工艺研究.甘肃中医学院学报,2015,32(6):26
‑
29.]。
[0005]用纯酶预处理植物原料，酶的使用量往往较大，其成本不容忽视，而且植物细胞壁由多种成分构成，单用一种酶水解难以取得非常理想的效果。为了提高酶解提取的效果，许多研究采用复合酶法，就是同时使用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等2种及2种以上的酶，虽然可以显著提高产物提取得率，但多种酶的使用，无疑增加了提取成本。
[0006]微生物产生酶的能力非常强大，尤其是一些放线菌和霉菌，可以产生多种分解植物组织的水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等。因此，如果利
用某种微生物在合适的条件下培养，发酵液中含有大量的水解酶，利用发酵液(粗酶液)直接水解植物原料，这些酶能协同分解细胞壁成分，从而有利于有效成分的释放，能显著提高提取得率；而且，使用未经分离纯化的粗酶液，降低了酶的成本。
[0007]为了提高枇杷叶总黄酮的提取得率，本专利技术用微生物发酵制备的粗酶液酶解枇杷叶，可使枇杷叶总黄酮的提取得率大幅度提高。
(三)
技术实现思路

[0008]本专利技术目的是提供一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法，将微生物酶解技术应用于枇杷叶总黄酮的超声提取，枇杷叶经微生物发酵制备的粗酶液酶解后，总黄酮的提取得率可以大幅度提高。
[0009]本专利技术采用的技术方案是：
[0010]本专利技术提供一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法，所述方法为：(1)垫状青霉(Penicillium pulvillorum)EJ2
‑
16经产酶培养基培养，获得的发酵液过滤，收集的滤液为粗酶液；所述垫状青霉(Penicillium pulvillorum)EJ2
‑
16，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62907，保藏日期2022年10月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070；(2)将粗酶液与枇杷叶粉混合，于40
–
45℃条件酶解4
–
5h，再往酶解体系中加入无水乙醇超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；(3)总黄酮提取液经减压蒸干，乙醇溶解、离心和真空干燥，得总黄酮提取物。
[0011]进一步，所述步骤(1)中的垫状青霉EJ2
‑
16发酵制备粗酶液的方法为：将垫状青霉EJ2
‑
16孢子接种于产酶培养基中，于30℃、200
–
250r/min振荡培养64
–
72h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：玉米粉40
–
50g/L，蛋白胨5
–
6g/L，(NH4)2SO44
–
5g/L，KH2PO
4 3
–
5g/L，MgSO4·
7H2O 0.5
–
1.0g/L，CaCl
2 0.3
–
0.5g/L，FeSO4·
7H2O 0.1
–
0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0
–
6.5。
[0012]进一步，优选所述产酶培养基组成为：玉米粉40g/L，蛋白胨6g/L，(NH4)2SO
4 4g/L，KH2PO
4 5g/L，MgSO4·
7H2O 0.5g/L，CaCl
2 0.5g/L，FeSO4·
7H2O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。
[0013]本专利技术所述垫状青霉EJ2
‑
16在产酶培养前，需要先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得垫状青霉EJ2
‑
16孢子液，按体积分数5％
–
6％的量接入产酶培养基进行培养，具体产酶培养方法为：
[0014]①
孢子液制备：将垫状青霉EJ2
‑
16接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基，于30℃培养72
–
80h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得垫状青霉EJ2
‑
16孢子液；所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/L的质量浓度配制，pH自然(实测6.5)，高压蒸汽121℃灭菌20min。
[0015]②
产酶培养：用步骤
①
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法，其特征在于，所述方法为：(1)垫状青霉(Penicillium pulvillorum)EJ2
‑
16经产酶培养基培养，获得的发酵液过滤，收集的滤液为粗酶液；所述垫状青霉EJ2
‑
16，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62907，保藏日期2022年10月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070；(2)将粗酶液与枇杷叶粉混合，于40
–
45℃条件酶解4
–
5h，再往酶解体系中加入无水乙醇超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；(3)总黄酮提取液经减压蒸干，乙醇溶解、离心和真空干燥，得总黄酮提取物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)粗酶液的制备方法为：将垫状青霉EJ2
‑
16孢子接种于产酶培养基中，于30℃、200
–
250r/min振荡培养64
–
72h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：玉米粉40
–
50g/L，蛋白胨5
–
6g/L，(NH4)2SO44
–
5g/L，KH2PO
4 3
–
5g/L，MgSO4·
7H2O 0.5
–
1.0g/L，CaCl
2 0.3
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0.5g/L，FeSO4·
7H2O 0.1
–
0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0
–
6.5。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述产酶培养基组成为：玉米粉40g/L，蛋白胨6g/L，(NH4)2SO
4 4g/L，KH2PO
4 5g/L，MgSO4·
7H2O 0.5g/L，CaCl
2 0.5g/L，Fe...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅建凤，宁恬，赵翔，易喻，应国清，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：