聚体蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种聚体蛋白的纯化方法，包括如下步骤：S1：对含聚体蛋白的细胞发酵液进行亲和层析，收集亲和层析液；S2：对所述亲和层析液进行超滤，收集超滤浓缩液；S3：对所述超滤液进行阴离子层析，收集阴离子层析液；S4：对所述阴离子层析液进行阳离子层析，收集阳离子层析液；S5：对所述阳离子层析液进行复合膜过滤。上述聚体蛋白的纯化方法，能够实现较大程度地去除如HCPs等杂质，最后得到纯度极高的聚体蛋白。同时，该纯化方法操作简单、回收率高，有利于大规模的工业化生产。于大规模的工业化生产。于大规模的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
聚体蛋白的纯化方法


[0001]本申请涉及蛋白纯化
，特别是涉及一种聚体蛋白的纯化方法。

技术介绍

[0002]疫苗在疾病预防中发挥着极其重要的作用，保证疫苗的质量是保证疫苗始终如一地发挥其特定功效的关键。与单克隆抗体的经典结构相比，疫苗的作用机制往往包括多个结合点位的识别，结构相对比较复杂，这种复杂程度不仅体现在糖型及三维结构上，还体现在疫苗的多聚体结构。
[0003]在传统和新型疫苗的制备中，应用先进的分离纯化技术是提高疫苗效力、减少副作用的有效手段。然而，对于疫苗这一聚体蛋白的纯化而言，由于其结构复杂，浓度低（通常＜1g/L的浓度），利用传统的离心、过滤和沉淀技术进行纯化，所得产品中的单体、聚集体及其他杂质，特别是宿主细胞蛋白（HCP）和宿主DNA的含量较高，副作用明显，无法满足疫苗质量的要求。

技术实现思路

[0004]基于此，本申请提供一种聚体蛋白的纯化方法，该纯化方法能够有效去除聚体蛋白中的杂质，提高聚体蛋白的纯度。
[0005]具体技术方案如下：一种聚体蛋白的纯化方法，包括如下步骤：S1：对含聚体蛋白的细胞发酵液进行亲和层析，收集亲和层析液；S2：对所述亲和层析液进行超滤，收集超滤浓缩液；S3：对所述超滤浓缩液进行阴离子层析，收集阴离子层析液；S4：对所述阴离子层析液进行阳离子层析，收集阳离子层析液；S5：对所述阳离子层析液进行复合膜过滤。
[0006]在其中一个实施例中，步骤S1中，所述亲和层析采用亲和层析柱进行，所述亲和层析柱填料以扁豆凝集素为亲和介质的亲和填料。
[0007]在其中一个实施例中，步骤S1中，所述亲和层析采用的洗脱程序包括：先以0.005M~0.015MPBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比0.3%~0.5%甘露糖的0.005M~0.015M PBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比9%~11%甘露糖的0.005M~0.015M 的PBS 缓冲液进行聚体蛋白洗脱。
[0008]在其中一个实施例中，步骤S2中，所述超滤采用的超滤膜的膜孔径为100KDa。
[0009]在其中一个实施例中，步骤S2中，进行所述超滤之前，先采用0.005M~0.015MPBS缓冲液对所述超滤采用的超滤膜进行平衡。
[0010]在其中一个实施例中，步骤S3中，所述阴离子层析采用阴离子层析柱进行，所述阴离子层析柱的填料为以
‑
N
+
(CH3)3为配基的阴离子填料。
[0011]在其中一个实施例中，步骤S3中，所述阴离子层析采用的洗脱程序包括：以15mM~
25mM柠檬酸钠
‑
柠檬酸缓冲液进行淋洗。
[0012]在其中一个实施例中，步骤S4中，所述阳离子层析采用阳离子层析柱进行，所述阳离子层析柱的填料为以
‑
SO3H为配基的阳离子填料。
[0013]在其中一个实施例中，步骤S4中，所述阳离子层析采用的洗脱程序包括：以含0.5M~1.5M NaCl的15mM~25mM柠檬酸钠
‑
柠檬酸缓冲液进行淋洗。
[0014]在其中一个实施例中，步骤S5中，所述复合膜为具有季胺功能团以及胍功能团的膜。
[0015]在其中一个实施例中，步骤S5中，进行所述复合膜过滤之前，先采用0.005M~0.015MPBS缓冲液对所述复合膜进行平衡。
[0016]在其中一个实施例中，所述聚体蛋白为三聚体蛋白。
[0017]上述聚体蛋白的纯化方法，依次通过亲和层析、超滤、阴离子层析、阳离子层析和复合膜过滤的纯化步骤对含聚体蛋白的细胞发酵液进行纯化处理，能够实现较大程度地去除如HCPs等杂质，最后得到纯度极高的聚体蛋白。同时，该纯化方法操作简单、回收率高，有利于大规模的工业化生产。
[0018]另外，上述聚体蛋白的纯化方法的步骤过程中聚体蛋白不易分解，且制备得到的聚体蛋白性质稳定。
附图说明
[0019]图1为本申请一示例的聚体蛋白的纯化方法的流程图。
具体实施方式
[0020]以下结合具体实施例对本申请的聚体蛋白的纯化方法作进一步详细的说明。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本专利技术公开内容理解更加透彻全面。
[0021]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。
[0022]本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
[0023]本申请中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
[0024]本申请中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相
‑
固相混合均指质量百分比，对于液相
‑
液相混合指体积百分比。
[0025]本申请中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
[0026]本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间
内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
[0027]本申请中的室温一般指4℃~30℃，较佳地指20
±
5℃。
[0028]若无特别说明，本申请中涉及的溶液的溶剂均为水。
[0029]宿主细胞蛋白（HCP）是由用于生产重组产品的宿主细胞产生或编码的与预期重组产品无关的蛋白，而DNA是宿主细胞分解后的DNA片段。与重组产品一样，HCP也可以被宿主以许多类型的翻译后修饰(posttranslational modifications, PTMs)进行修饰。HCP和DNA是生物制品中主要工艺相关杂质，是生物药品的强制性关键质量属性（CQA），因为这些残留杂质会影响产品质量、功效和安全性，并诱导或增强免疫原性，因此需要通过纯化工艺充分去除。同时HCPs是一种具有多种理化性质的复杂混合物，某些亚种群可以与目标产品结合，尽管通常以少量存在，但将它们降到普遍接受的水平是很具有挑战性的，工业界为去除它们付出了大量的努力和成本。
[0030]聚体蛋白纯化的重大挑战是上游细胞发酵培养过程中生产的聚体蛋白产量很低（<1g/L），同时HCP和DNA等杂质的含量很高，杂质和聚体蛋白的相对比例很大，且杂质的组成复杂。杂质的含量和组成越复杂，越要求下游工艺（Down本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：对含聚体蛋白的细胞发酵液进行亲和层析，收集亲和层析液；S2：对所述亲和层析液进行超滤，收集超滤浓缩液；S3：对所述超滤浓缩液进行阴离子层析，收集阴离子层析液；S4：对所述阴离子层析液进行阳离子层析，收集阳离子层析液；S5：对所述阳离子层析液进行复合膜过滤。2.根据权利要求1所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析采用亲和层析柱进行，所述亲和层析柱填料以扁豆凝集素为亲和介质的亲和填料。3.根据权利要求1或2所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析采用的洗脱程序包括：先以0.005M~0.015MPBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比0.3%~0.5%甘露糖的0.005M~0.015M PBS缓冲液淋洗3CV~5CV，再以含质量百分比9%~11%甘露糖的0.005M~0.015M 的PBS 缓冲液进行聚体蛋白洗脱。4.根据权利要求1所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，所述超滤采用的超滤膜的膜孔径为100KDa。5.根据权利要求1或4所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤S2中，进行所述超滤之前，先采用0.005M~0.015MPBS缓冲液对所述超滤采用的超滤膜进行平衡。6.根据权利要求1所述的聚体蛋白的纯化方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾如林，陈祖棠，仇金树，阚子义，罗顺，
申请(专利权)人：上海健士拜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：