DNA标签及其应用制造技术

提供一种用于检测微量变异的DNA标签，该标签具有选自下列至少之一的序列：(1)HHATHHHTCACCHHATHHH；或(2)HHHTAHHTAHHHTAHH，其中，H代表A、T或C。T或C。

【技术实现步骤摘要】
DNA标签及其应用
[0001]优先权信息
[0002]无


[0003]本专利技术涉及生物测序领域，具体地，本专利技术涉及DNA标签、DNA接头、构建测序文库的方法、测序文库以及测序方法。

技术介绍

[0004]高通量测序技术的迅猛发展将基因组学水平的研究带入一个新的时期。它不仅可以进行大规模基因组测序，还可以用于基因表达分析、非编码小分析RNA的鉴定等。在医学领域，高通量测序技术打破了疾病研究过程中的通量限制，使得对疾病的多层面、全方位研究成为可能，为疾病的预防、诊断及治疗提供了有效手段。在基因组、基因表达研究或医学遗传学检测中，DNA测序测定、DNA分子定量、RNA丰度分析等具有重要意义。然而，由于高通量测序技术在测序前需要对样本DNA/RNA进行PCR扩增，PCR普遍存在扩增偏向性、扩增错误等问题，同时基于特定测序平台和测序环境，在测序过程中也会产生测序错误，从而导致约1％的碱基不能正确识别，进而限制了对罕见变异和低频变异的检测。
[0005]单分子标签(Unique Molecular Identifiers，UMI)技术是通过在DNA/RNA分子片段末端随机添加一段人工合成序列(一般5
‑
12bp)，作为识别该DNA片段的唯一标签，用于记录样本原始DNA/RNA信息。早在2011年由Isaac Kinde,Jian Wu等人为了检测罕见突变运用了唯一标示符(Unique Identifier，UID)技术，这一技术与UMI技术类同。紧接着在2012年，为了解决确定单样本中两个不同分子的相对丰度或多分子的绝对定量，由Teemu Kivioja,Anna等人首次使用了单分子标签(UMI)技术进行多分子绝对量的计数。同年Michael W.Schmitt等人采用了进一步UMI和双工测序(Duplex Sequencing，DS)技术进行极罕见突变的检测。同样是Scott R Kennedy,Michael W Schmitt等在2014年又针对有效的DS接头合成、文库制备、目标富集以及数据分析流程概述提供了详细的协议。接下来在2015年Michael W Schmitt等又运用DS技术对ABL1基因上的罕见突变进行了检测。
[0006]然而，对于基因组极微量变异的检测仍需要进一步开拓。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
[0008]本申请专利技术人基于独创性的UMI序列，研发了一套基因组极微量变异检测和验证系统。本系统可以检测的突变频率最低可以达到0.01％，可以实现与体细胞、干细胞等累积突变诱发的癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等的早期筛查。
[0009]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种DNA标签。根据本专利技术的实施例，所述标签具有选自下列至少之一的序列：(1)HHATHHHTCACCHHATHHH(SEQ ID NO：10)；以及(2)HHHTAHHTAHHHTAHH(SEQ ID NO：11)，其中，H代表A、T或C。利用根据本专利技术实施例的标签，可
实现对极微量(突变频率低至0.01％)变异的检测和验证，对体细胞、干细胞等累积突变诱发的癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等的早期筛查具有重要意义。
[0010]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种DNA接头。根据本专利技术的实施例，所述DAN接头含有前面所述的DNA标签。利用根据本专利技术实施例的DNA接头构建测序文库，进而对测序文库进行测序，可检测出极微量的变异，对突变频率低至0.01％的微量突变或罕见突变的检测灵敏度高。根据本专利技术实施例的DNA接头对体细胞、干细胞等累积突变诱发的癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等的早期筛查具有十分重要的意义。
[0011]在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了前面所述的DNA标签和前面所述的DNA接头在在检测微量变异中的应用。利用根据本专利技术实施例的标签和接头，可实现对极微量(突变频率低至0.01％)变异的检测和验证，对体细胞、干细胞等累积突变诱发的癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等的早期筛查具有重要意义。
[0012]在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种构建测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括将连接有前面所述的DNA接头的核酸分子进行富集处理，以便获得测序文库。利用根据本专利技术实施例的方法构建的测序文库，可用于极微量变异的检测，极微量变异的突变频率可低至0.01％。
[0013]在本专利技术的第五方面，本专利技术提出了一种测序文库。根据本专利技术的实施例，所述测序文库是通过前面所述的构建测序文库的方法获得。对该测序文库进行高通量测序，可以检测的突变频率最低可以达到0.01％，可以实现对体细胞、干细胞等累积突变诱发的癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等的早期筛查。
[0014]在本专利技术的第六方面，本专利技术提出了一种测序方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括将前面所述的测序文库进行测序和数据分析处理。利用根据本专利技术实施例的测序方法，可实现低频突变的检测和验证，同时根据测序深度的不同UMI技术可以检测的突变频率可以达到0.01％，可以有效应用于体细胞、干细胞等累积突变诱发的癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等的早期筛查。
[0015]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0016]本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0017]图1为根据本专利技术一个实施例的极微量变异检测系统整体分析流程图；
[0018]图2为根据本专利技术一个实施例的数据分析处理流程图；
[0019]图3为根据本专利技术一个实施例的PCR产物的纯化定量及Sanger测序验证图；
[0020]图4为根据本专利技术一个实施例的利用检测2100检测加“T”策略制备的接头的结果图；
[0021]图5为根据本专利技术一个实施例的利用检测2100检测加anchor策略制备的接头的结果图；
[0022]图6为根据本专利技术一个实施例的利用检测2100检测酶切策略制备的接头的结果图；
[0023]图7为根据本专利技术一个实施例的利用检测2100检测测序文库的结果图；
[0024]图8为根据本专利技术一个实施例的样本的累积深度分布图；
[0025]图9为根据本专利技术一个实施例的样本的深度分布图；
[0026]图10为根据本专利技术实施例的样本的UMI序列集分布图；以及
[0027]图11为根据本专利技术实施例的构建双工一致性序列结果图。
[0028]专利技术详细描述
[0029]下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0030]需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA标签，其特征在于，包括下列序列：HHHTAHHTAHHHTAHH，其中，H代表A、T或C。2.一种DNA接头，其特征在于，含有权利要求1所述的DNA标签。3.根据权利要求2所述的DNA接头，其特征在于，所述接头具有粘性末端dT。4.根据权利要求3所述的DNA接头，其特征在于，进一步包括：锚定序列，所述锚定序列形成在所述粘性末端dT与所述标签序列之间。5.根据权利要求4所述的DNA接头，其特征在于，所述锚定序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。6.根据权利要求3所述的DNA接头，其特征在于，所述粘性末端dT形成在所述DNA标签的3
’
末端。7.根据权利要求5所述的DNA接头，其特征在于，所述接头是依次通过梯度退火处理、dDTP延伸处理以及酒精纯化补nick处理获得的。8.根据权利要求3所述的DNA接头，其特征在于，进一步包括：酶切序列，所述酶切序列形成在所述DNA标签的末端，其中，所述酶切序列携带适于产生粘性末端dT的限制性内切酶识别位点。9.根据权利要求8所述的DNA接头，其特征在于，所述酶切序列为HphI特异性识别位点。10.根据权利要求9所述的DNA接头，其特征在于，所述接头是依次通过梯度退火处理、dDTP延伸处理以及Hphl酶切处理获得的。11.权利要求1所述的DNA标签和权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴相花，甄贺富，袁玉英，张现东，张爱萍，张红云，刘娜，尹烨，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：