一种自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物及其筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物及其筛选方法，以枯草期和青草期苏尼特绵羊作为研究对象，探讨不同组织脂肪分解代谢的差异，通过qRT

【技术实现步骤摘要】
一种自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物及其筛选方法


[0001]本专利技术一种自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物及其筛选方法，属于生物技术


技术介绍

[0002]脂肪组织中甘油三酯储存的脂肪酸的动员需要脂肪分解酶。功能失调的脂肪分解影响能量稳态，并可能导致肥胖和胰岛素抵抗的发病机制。激素敏感脂肪酶(HSL)是哺乳动物脂肪组织中唯一已知水解甘油三酯的酶。脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)，催化甘油三酯水解的第一步。ATGL含有植物酰基水解酶共有的“patatin结构域”。ATGL在小鼠和人类的脂肪组织中高度表达。它对三酰甘油具有高度的底物特异性，并与脂滴有关。抑制ATGL明显降低总脂肪酰基水解酶活性。因此，ATGL和HSL协调分解哺乳动物脂肪组织中储存的甘油三酯。
[0003]脂肪分解是由甘油三酯的水解和脂肪酸的氧化这两个过程组成的。在细胞水平上就对脊椎动物生理学中脂肪分解下了定义，其主要被分为三个过程：第一是在胃肠道内对饮食中脂肪的分解代谢；第二是在血管内对血液中脂蛋白相关的甘油三酯进行的水解；第三是在脂肪细胞内通过一些酶脂解催化储存在细胞脂滴(LDs)中的甘油三酯的水解。这三个过程的最终目的就是用于脂肪酸的后续输出和自身的代谢。动物、种子植物和真菌通常以细胞内甘油三酯(TG)沉积的形式储存过量的能量底物。在哺乳动物中，甘油三酯储存在脂肪组织中，它们是提供能量的主要来源。大量研究表明ATGL能够增强脂肪分解和抑制脂肪沉积，从而提高动物们的生长速度，降低料肉比。
[0004]由于枯草期牧草所含的养分价值不高，使得该时期绵羊长期处于营养不佳的状态。

技术实现思路

[0005]本专利技术克服了现有技术存在的不足，提供了一种自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物及其筛选方法，通过探讨枯草期和青草期绵羊不同组织脂肪分解代谢的差异，为枯草期绵羊的脂肪代谢提供理论依据，从而提高绵羊养殖效益。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种诊断自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物，包括脂肪组织中的甘油三酯水解、脂肪酸氧化、cAMP
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PKA信号通路关键的一种或多种。本专利技术所述诊断标志物对于自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断具有较好的灵敏性和特异性。
[0007]优选地，脂肪组织的甘油三酯水解包括ATGL、ABHD5、PLIN2，其中，甘油三酯水解指ATGL(升高)、PLIN2(升高)。
[0008]优选地，脂肪组织的脂肪酸氧化包括ACADL、CPT
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1B，其中，脂肪酸氧化指ACADL(升高)、CPT
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1B(升高)。
[0009]优选地，cAMP
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PKA信号通路关键基因包括ATGL、GNAS、PRKACA，其中，cAMP
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PKA信号
通路关键基因指GNAS(升高)、PRKACA(升高)。
[0010]本专利技术涉及一种自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物的筛选方法，包括以下步骤：
[0011](1)采集脂肪组织、肌肉组织和肝脏总RNA提取与鉴定RNA质量。
[0012](2)RNA反转录。
[0013](3)引物的设计与合成。
[0014](4)qRT
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PCR检测基因表达水平。
[0015](5)提取脂肪组织、肌肉组织和肝脏总蛋白运用蛋白质免疫印迹检测蛋白表达水平。
[0016](6)制备脂肪组织、肌肉组织和肝脏组织匀浆液，ELISA检测蛋白表达水平。
[0017]具体为：
[0018]包括以下步骤：
[0019]S1.总RNA提取与鉴定；
[0020]S2.反转录；
[0021]S3.引物的设计与合成；
[0022]S4.qRT
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PCR；
[0023]S5.蛋白质免疫印迹；
[0024]S6.酶联免疫法。
[0025]优选地，总RNA提取与鉴定包括以下具体步骤：
[0026]前期准备工作：所用耗材和器械均需要经过DEPC浸泡24小时和高压处理；
[0027]绵羊脂肪组织(皮下、肾周、尾脂)、肌肉组织(背腰最长肌、肱三头肌、肱二头肌)和肝脏样品提取总RNA的具体步骤如下：
[0028](1)从
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80℃在4℃环境下采集脂肪组织、肌肉组织和肝脏放入已灭菌后的1.5mL EP管中，向每个管中分别加入1mL的Trizol，然后将肌肉组织和肝脏使用匀浆机在冰浴下进行匀浆，脂肪组织则需要液氮研磨后，将其研磨好的粉末倒入EP管；
[0029](2)将处理好的匀浆液混匀后放在4℃环境下，静置30分钟；随后所有步骤均需在超净台内完成；
[0030](12)向每一个1.5mL的EP中加入200μl氯仿，反复颠倒震荡混匀；
[0031](13)将离心管放入高速冷冻离心机(D
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3752)，在4℃的温度下，将转速调制到13000转/分钟，离心15分钟；
[0032](14)将离心后的上清液重新转移至新的1.5mL的Ep管中，再向每个新管内加入500uL的异丙醇，上下缓慢颠倒混匀，在室温下静置10分钟；
[0033](15)将静置好的离心管放入高速冷冻离心机(D
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3752)，在4℃的温度下，转速保持13000转/分钟，离心15分钟；
[0034](16)弃去离心后的上清液，也可以用10μL的枪头将底部残留的液体吸走，再向管内加入1mL的75％DEPC酒精，上下缓慢颠倒；
[0035](17)将离心管再次放入高速冷冻离心机(D
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3752)，在4℃温度下，将转速调整到7500转/分钟，离心5分钟；
[0036](18)重复一次(7)(8)步骤；
[0037](19)用移液枪吸走残留在EP管底部的液体，将EP管倒扣置于滤纸上干燥管内沉淀(具体干燥时间根据实际情况而定)；
[0038](20)根据所提取的RNA总量加入0.1％的DEPC水，用枪头反复吹打，使得底部沉淀能完全溶解，分装备用；
[0039]总RNA质量鉴定：鉴定总RNA质量，用1％琼脂糖凝胶电泳，实验条件为：120V，20min。用2.5μL的移液枪吸取1μL所提取的总RNA，点涂到核酸蛋白浓度仪上来检测其浓度。依据A260/280和A260/230的比值对RNA的质量进行一个评判。
[0040]优选地，反转录包括以下具体步骤：
[0041]反转录：将前期已经提取的RNA样品反转录成cDNA，此反应在密闭的0.2mL的EP管内进行，反应体系为10μL，试剂的具体使用量见表1；
[0042]优选地，引物的设计与合成包括以下具体步骤：
[0043]所测绵羊物种的基因序列均来源于美国国立生物信息技术中心(NCBI)，运用Primer
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物，其特征在于，包括脂肪组织中的甘油三酯水解、脂肪酸氧化、cAMP
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PKA信号通路关键的一种或多种。2.一种根据权利要求1所述的自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.总RNA提取与鉴定；S2.反转录；S3.引物的设计与合成；S4.qRT
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PCR；S5.蛋白质免疫印迹；S6.酶联免疫法。3.根据权利要求2所述的一种根据权利要求1所述的自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物的筛选方法，其特征在于，总RNA提取与鉴定包括以下具体步骤：前期准备工作：所用耗材和器械均需要经过DEPC浸泡24小时和高压处理；绵羊脂肪组织(皮下、肾周、尾脂)、肌肉组织(背腰最长肌、肱三头肌、肱二头肌)和肝脏样品提取总RNA的具体步骤如下：(1)从
‑
80℃在4℃环境下采集脂肪组织、肌肉组织和肝脏放入已灭菌后的1.5mL EP管中，向每个管中分别加入1mL的Trizol，然后将肌肉组织和肝脏使用匀浆机在冰浴下进行匀浆，脂肪组织则需要液氮研磨后，将其研磨好的粉末倒入EP管；(2)将处理好的匀浆液混匀后放在4℃环境下，静置30分钟；随后所有步骤均需在超净台内完成；(3)向每一个1.5mL的EP中加入200μl氯仿，反复颠倒震荡混匀；(4)将离心管放入高速冷冻离心机(D
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3752)，在4℃的温度下，将转速调制到13000转/分钟，离心15分钟；(5)将离心后的上清液重新转移至新的1.5mL的Ep管中，再向每个新管内加入500uL的异丙醇，上下缓慢颠倒混匀，在室温下静置10分钟；(6)将静置好的离心管放入高速冷冻离心机(D
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3752)，在4℃的温度下，转速保持13000转/分钟，离心15分钟；(7)弃去离心后的上清液，也可以用10μL的枪头将底部残留的液体吸走，再向管内加入1mL的75％DEPC酒精，上下缓慢颠倒；(8)将离心管再次放入高速冷冻离心机(D
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3752)，在4℃温度下，将转速调整到7500转/分钟，离心5分钟；(9)重复一次(7)(8)步骤；(10)用移液枪吸走残留在EP管底部的液体，将EP管倒扣置于滤纸上干燥管内沉淀(具体干燥时间根据实际情况而定)；(11)根据所提取的RNA总量加入0.1％的DEPC水，用枪头反复吹打，使得底部沉淀能完全溶解，分装备用；总RNA质量鉴定：鉴定总RNA质量，用1％琼脂糖凝胶电泳，实验条件为：120V，20min；用2.5μL的移液枪吸取1μL所提取的总RNA，点涂到核酸蛋白浓度仪上来检测其浓度，依据A260/280和A260/230的比值对RNA的质量进行一个评判。
4.根据权利要求2所述的一种根据权利要求1所述的自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物的筛选方法，其特征在于，反转录包括以下具体步骤：反转录：将前期已经提取的RNA样品反转录成cDNA，此反应在密闭的0.2mL的EP管内进行，反应体系为10μL，试剂的具体使用量见表1。5.根据权利要求2所述的一种根据权利要求1所述的自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物的筛选方法，其特征在于，引物的设计与合成包括以下具体步骤：所测绵羊物种的基因序列均来源于美国国立生物信息技术中心(NCBI)，运用Primer
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BLAST设计引物并检测其特异性，β
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actin为内参基因，Primer引物由上海生工生物工程有限公司合成，具体引物设计的信息见表2。6.根据权利要求2所述的一种根据权利要求1所述的自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物的筛选方法，其特征在于，qRT
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PCR包括以下具体步骤：qRT
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PCR：将反转录产物cDNA稀释后进行实时荧光定量PCR反应，此反应在密闭的八连管内进行，反应体系为10μL，试剂的具体使用量见表3。7.根据权利要求2所述的一种根据权利要求1所述的自然放牧下绵羊脂肪代谢紊乱的诊断标志物组合物的筛选方法，其特征在于，蛋白质免疫印迹包括以下具体步骤：总蛋白的提取：(1)将
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80℃冷冻保存的背腰最长肌和肝脏在4℃环境下切割组织，随后将称量后的样品装于1.5mL EP管内，并向管中加入500μL的RIPA蛋白裂解液和5μL的PMSF，在匀浆机下进行组织匀浆，将
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80℃冷冻保存的皮下脂肪组织用研钵在液氮中研磨，加入1mL RIPA蛋白质裂解液和10μL的PMSF共同置于1.5mL EP管中，匀浆的过程均在冰上操作；(2)将EP管放入超高速离心机(D
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3752)下，在4℃的温度下，转速设定为13000转/分钟，离心10分钟；(3)离心后，吸取上清液，并将其分装于200μL EP管中，以备后续实验的使用；BCA测量总蛋白浓度：依照Seven创新(北京)生物科技有限公司BCA蛋白浓度测定试剂盒的操作方法进行，先配制出一定量的BCA工作液(即配即用)，充分混匀后置于避光处静待使用，按照说明书在96孔板上加样，随后绘制出标准曲线方程式，将测定绵羊蛋白样品的吸光度值代入公式，计算蛋白浓度；主要的溶液配制：(1)30％聚丙烯酰胺贮存液称量丙烯酰胺30g，然后称取0.8g的甲叉，在没有光的环境下，将两种物质加入到100mL的容量瓶中，随后用超纯水进行容量瓶定容，颠倒混匀静置后，滤纸过滤到棕色瓶中，4℃贮存；(2)10％SDS溶液在称量仪上放好称量纸，称取SDS 10g，倒入到100mL容量瓶中，使用超纯水给容量瓶定容，然后颠倒混匀，静置后，室温贮存；(3)AP(10％过硫酸铵)溶液在称量仪上放好称量纸，然后称取0.1g的过硫酸铵，随后加入到1.5mLEP管中，再用1mL的移液枪吸取1mL的超纯水，加入到EP管中，振荡混匀静置后，放置于4℃贮存，标记日期，通
常有效期为一周；(4)SDS
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PAGE电泳缓冲液在称量仪上放好称量纸，分别称取3.03g的Tris，18.77g的甘氨酸和1g的SDS加入到100mL容量瓶中，使用超纯水给容量瓶定容，颠倒混匀静置...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁琛，张建海，赵阳飞，郭玉洁，韩永利，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：