一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法。该方法是利用基因编辑技术敲除甘蓝型油菜BnPUB18

【技术实现步骤摘要】
一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法。

技术介绍

[0002]油菜作为一种重要的油用经济作物，是排名仅次于水稻、小麦、玉米、大豆的第五大作物，然而油菜在种植过程中容易遭受干旱、低温、盐、水渍、高温等非生物胁迫和虫害、病害等生物胁迫，不仅使油菜的生长发育遭受很大的威胁，而且严重影响油菜的产量和品质。同时，随着全球气候的变暖，越来越多的极端环境也极大的威胁着的油菜生产以及产业发展，因此，解析油菜的抗逆机理，深度挖掘抗逆关键基因，利用生物技术新手段快速创制抗逆的油菜种质对我国油料作物产业的健康发展具有重要意义。
[0003]传统的育种已经发展到了平台期，需要新的技术打破传统的育种周期和提高育种质量。基因编辑技术作为生命科学领域的新技术，已在多个领域被广泛应用，在农业领域，基因编辑技术有助于靶向敲除目的基因，实现目标基因的精准编辑，从而快速、精准改良作物的某一不良缺陷性状，缩短作物的育种进程。
[0004]植物为了应对干旱胁迫，从分子以及生理水平上进化出一系列调控机制来抵抗逆境，常见的机制有抗旱性、耐旱性以及避旱性。对油菜耐旱性分子机理及其产量的研究有助于更好的了解其抗旱机制，一方面可以通过分子标记筛选抗旱性更强、产量更高的品系，另一方面也可以通过转基因技术获取耐旱性更强、产量更高的株系用于农业生产，从而提高油菜的产量。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了提高油菜的耐旱性，提供以下技术方案：
[0006]本专利技术第一方面，提供一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法，其是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除甘蓝型油菜BnPUB18
‑
6A、BnPUB18
‑
5C、BnPUB19
‑
1A或BnPUB19
‑
1C基因中的至少一种；
[0007]其中，所述BnPUB18
‑
6A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
[0008]所述BnPUB18
‑
5C的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
[0009]所述BnPUB19
‑
1A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
[0010]所述BnPUB19
‑
1C的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0011]本专利技术第二方面，提供一种所述BnPUB18
‑
6A基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。
[0012]本专利技术第三方面，提供一种所述BnPUB18
‑
5C基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。
[0013]本专利技术第四方面，提供一种所述BnPUB19
‑
1A基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。
[0014]本专利技术第五方面，提供一种所述BnPUB19
‑
1C基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用
途。
[0015]本专利技术第六方面，提供一种耐旱性改良的甘蓝型油菜的培育方法，包括以下步骤：
[0016]S1、sgRNA靶位点选择：根据序列特点分别找到BnPUB18
‑
6A和BnPUB18
‑
5C的共有序列及BnPUB19
‑
1A和BnPUB19
‑
1C的共有序列，设计sgRNA序列；
[0017]S2、引物合成：利用S1中sgRNA合成引物；
[0018]S3、构建CRISPR/Cas9载体：以pCBC
‑
DT1T2质粒为模板，用所述引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后，用Bsa I分别酶切pHSE401载体和纯化后的扩增产物，用T4连接酶连接纯化后的酶切产物，转化至大肠杆菌感受态，得到包含BnPUB18和BnPUB19双靶点的CRISPR/Cas9表达载体；
[0019]S3、获得耐旱性改良植株：将所述CRISPR/Cas9表达载体转化至甘蓝型油菜，获得耐旱性改良的甘蓝型油菜植株。
[0020]优选地，sgRNA序列有两个，第一个sgRNA位于BnPUB18
‑
5C和BnPUB18
‑
6A外显子的共有序列上，第二个sgRNA位于BnPUB19
‑
1A和BnPUB19
‑
1C外显子的共有序列上。
[0021]优选地，第一个sgRNA的序列为5
’‑
TGCAAATCAATCTCCGTAAC
‑3’
，第二个sgRNA的序列为5
’‑
CCGGGTCGGGTTAATACCAG
‑3’
。
[0022]优选地，所述引物为BnPUB18
‑
T1
‑
BsF、BnPUB18
‑
T1F、BnPUB19
‑
T2
‑
BsR及BnPUB19
‑
T2R；
[0023]所述BnPUB18
‑
T1
‑
BsF的序列如SEQ ID NO.5所示；
[0024]所述BnPUB18
‑
T1F的序列如SEQ ID NO.6所示；
[0025]所述BnPUB19
‑
T2
‑
BsR的序列如SEQ ID NO.7所示；
[0026]所述BnPUB19
‑
T2R的序列如SEQ ID NO.8所示。
[0027]对比现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0028]1、本专利技术利用CRISPR/Cas9技术对BnPUB18/BnPUB19基因进行编辑，通过农杆菌介导法将携带BnPUB18/BnPUB19的基因编辑载体转入到油菜受体材料K407中，对靶向基因BnPUB18/BnPUB19进行了精准编辑，获得了大量的基因编辑植株，通过对后代株系检测，获得了4个基因BnPUB18
‑
5C、BnPUB18
‑
6A、BnPUB19
‑
1A和BnPUB19
‑
1C均被编辑的植株GE3和GE5。
[0029]2、本专利技术对基因编辑突变体植株GE3和GE5进行自然干旱法处理，基因编辑株系在自然干旱21天后表现出极强的耐旱性，与基因编辑株系相比，野生型株系表现为叶片萎蔫、干枯、脱水皱缩等现象，复水后植株存活率仅为30％，而基因编辑突变体植株尽管干旱处理后虽然叶片萎蔫，但不严重，经复水后，植株存活率75％和68％，显著高于对照，且植株很快恢复了正常生长状态。
[0030]3、本专利技术对基因编辑突变体植株GE3和GE5进行自然干旱法处理，通过对干旱过程中植株的电导率、MDA含量、T
‑
AOC活性三个生理指标进行检测发现，GE3和GE5基因编辑株系的电导率和MDA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法，其特征在于，其是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除甘蓝型油菜BnPUB18
‑
6A、BnPUB18
‑
5C、BnPUB19
‑
1A或BnPUB19
‑
1C基因中的至少一种；其中，所述BnPUB18
‑
6A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述BnPUB18
‑
5C的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述BnPUB19
‑
1A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述BnPUB19
‑
1C的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.一种权利要求1所述BnPUB18
‑
6A基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。3.一种权利要求1所述BnPUB18
‑
5C基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。4.一种权利要求1所述BnPUB19
‑
1A基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。5.一种权利要求1所述BnPUB19
‑
1C基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。6.一种耐旱性改良的甘蓝型油菜的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、sgRNA靶位点选择：根据序列特点分别找到权利要求1中BnPUB18
‑
6A和BnPUB18
‑
5C的共有序列及BnPUB19
‑
1A和BnPUB19
‑
1C的共有序列，设计sgRNA序列；S2、引物合成：利用S1中sgRNA合成引物；S3、构建CRISPR/Cas9载体：以pCBC
‑
DT1T2质粒为模板，用所述引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后，用BsaI分别酶切pHSE...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彦锋，令狐斌，穆建新，宋敏，安然，黄淑华，董育红，韦世豪，关周博，朱彦涛，陈娜娜，
申请(专利权)人：陕西省杂交油菜研究中心，
类型：发明
国别省市：