一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用，分离富集方法的步骤包括：(1)干燥粉碎杜仲叶；(2)用有机溶剂浸泡回流提取两次得到杜仲叶总浸膏；(3)用AB

【技术实现步骤摘要】
一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用


[0001]本专利技术涉及天然产物与医药
，尤其涉及一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用。

技术介绍

[0002]导致残疾和认知缺陷的中风约占全世界死亡人数的5.2％，其中，以短暂或永久性脑血管闭塞导致的缺血性中风占据多数。缺血性中风或将引起脑梗塞、脑组织死亡以及局灶性神经元损伤，常表现出患有阿尔兹海默病、运动功能缺陷和智力受损等症状。缺血性中风和脑梗塞引起的神经元损伤包括三种机制，首先是神经元丢失，这是最直接的原因；其次，缺血导致的血管阻塞产生过度的活性氧(ROS)，加剧神经元损伤，从而导致功能缺陷；最后，缺血引起的炎症反应也是神经元损伤的一大诱因。治疗缺血性卒中的化学药物众多，例如组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、阿司匹林、依达拉奉、西洛他唑，但患者却苦于与之伴随的副作用。近年来，芍药苷、落新妇苷、青蒿琥酯、异槲皮素等天然产物渐渐被研究用于治疗缺血性卒中。天然产物在治疗缺血性卒中表现出了巨大的潜力。
[0003]植物源黄酮类化合物具有许多健康特性，研究表明其在细菌和病毒性传染病以及心血管疾病、癌症等退行性疾病中均具有保护作用。此外，与黄酮结构息息相关的抗氧化、肝保护活性、抗炎活性等也均已存在大量研究。杜仲黄酮类化合物在降“三高”、对抗炎症、病毒和癌症等方面也发挥了重要作用。杜仲叶中富含有的黄酮类成分已证明在抗氧化方面具有显著作用，可以作为大多数氧自由基的清除剂。杜仲是中国特有的杜仲属物种，自古以来，其药用价值引起了人们的广泛关注，杜仲的提取物或单体化合物例如环烯醚萜类、木脂素、绿原酸、酚类等已被应用于治疗高血压、高脂血症、糖尿病、抗衰老、免疫调节等方面；其叶子、树皮、茎和雄花皆可入药，杜仲树皮是常用于炮制中药的主要部位，但杜仲叶的研究与利用更利于杜仲资源的可持续发展。
[0004]目前没有任何有关杜仲叶黄酮在缺血性卒中应用的相关报道。
[0005]此外，杜仲资源的综合利用率低，长期以来，人们常以树皮作为主要药用部位。而传统的剥皮做法对杜仲树的损害极大，一定程度造成了杜仲资源的浪费。有研究表明杜仲叶中含有和杜仲皮相似的成分。对杜仲叶成分的活性研究是提高杜仲资源的利用率的必要途径。目前，杜仲叶总黄酮在抗氧化、抗菌方面均存在大量研究，但在缺血性卒中的报道鲜有报道。
[0006]氧化还原信号在病理过程和维持细胞内稳态至关重要。活性氧(ROS)可以激活蛋白激酶：CaMKII、PKG、PKA、ERK、PI3K、Akt、PKC、PDK、JNK、p38，生理水平控制细胞增殖和血管生成。适量的ROS对缺血后细胞生存有益，而进一步的增加将通过凋亡和自噬机制触发程序性死亡。
[0007]鉴于以上杜仲资源的利用现状，ROS信号分子在缺血性卒中的传导调控作用，本申请研究了如何提取获得高纯度、高回收率的杜仲叶总黄酮提取物，拓宽杜仲叶资源的利用率，并为治疗缺血性卒中提供新方案。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用，通过天然产物的色谱分离手段提取杜仲叶总黄酮提取物，可以抑制缺血后细胞中ROS积累，具有广泛的药用和保健价值，同时也可用于新的医学领域研究。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法，包括以下步骤：
[0011](1)将干燥后的杜仲叶粉碎制成粗粉；
[0012](2)取适量粗粉加入第一溶剂后于80℃回流提取两次，每次提取1.5h，合并两次提取液，回收第一溶剂后得到杜仲叶总浸膏；
[0013](3)分离：取杜仲叶总浸膏用适量蒸馏水溶解混匀，过滤除去不溶物，加入到AB
‑
8大孔树脂层析柱中，先用蒸馏水洗去杂质，以70％～100％浓度的乙醇为流动相洗脱，收集醇洗脱液；
[0014](4)回收乙醇后，于鼓风干燥箱中干燥，研磨制成粉末Ⅰ；
[0015](5)富集：取少量粉末Ⅰ溶解于第二溶剂中，加入Sephadex LH
‑
20葡聚糖凝胶层析柱中，以55％～90％浓度的乙醇为流动相进行洗脱，每1/10柱体积收集一管洗脱液；
[0016](6)将洗脱液在鼓风干燥箱中分别干燥制成粉末，筛选其中纯度为70％以上的粉末进行合并，得到粉末Ⅱ，即为高纯度杜仲叶总黄酮。
[0017]在一些具体的技术方案中，在步骤(2)中，第一溶剂为60％浓度的乙醇溶液。
[0018]在一些具体的技术方案中，在步骤(2)中，按照料液比1g：10ml的比例加入第一溶剂。
[0019]在一些具体的技术方案中，在步骤(3)中，流动相采用90％浓度的乙醇。
[0020]在一些具体的技术方案中，在步骤(4)中，干燥温度为60℃。
[0021]在一些具体的技术方案中，在步骤(5)中，第二溶剂为70％浓度的乙醇溶液。
[0022]在一些具体的技术方案中，在步骤(5)中，柱层析分离纯化时的上样浓度为20～30mg/ml。
[0023]在一些具体的技术方案中，在步骤(5)中，流动相采用70％浓度的乙醇。
[0024]在一些具体的技术方案中，在步骤(6)中，干燥温度为60℃。
[0025]第二方面，本专利技术提供了由上述分离富集方法制取得到的高纯度杜仲叶总黄酮在治疗缺血性卒中的用途。
[0026]第三方面，本专利技术提供了由上述分离富集方法制取得到的高纯度杜仲叶总黄酮在制备治疗缺血性脑卒中药物或在制备抑制ROS积累的药物中的用途。
[0027]在一些具体的技术方案中，杜仲叶总黄酮的药物浓度为0.3～5μg/ml。
[0028]优选的，杜仲叶总黄酮的药物浓度为1μg/ml。
[0029]与现有技术相比，本专利技术提供了一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法及应用，具备以下有益效果：
[0030](1)本申请通过研究杜仲叶黄酮具有的活性需要并制取高纯度的黄酮成分；大孔树脂是一种高效的有机高分子聚合物吸附脱附技术，具有吸附容量大、吸附剂易再生的优点，因其固有的方便、低操作成本、溶剂消耗以及产品中不存在化学残留的特点，在天然产
物分离过程中已得到广泛应用；Sephadex LH
‑
20葡聚糖凝胶树脂常被用于分离或纯化植物黄酮类化合物的最后一步，这是一种基于尺寸排阻色谱的分离纯化方法；本专利技术采用回流提取、AB
‑
8大孔树脂和Sephadex LH
‑
20葡聚糖凝胶层析法分离富集杜仲叶中的总黄酮，联用两种材料富集杜仲叶总黄酮的两步分离纯化操作可以得到高纯度、高回收率的黄酮产品，分离全程只使用无毒害的可供食品加工的乙醇作为有机溶剂流动相，其提取产物更具有药用价值和研究意义；并且，此种方法操作简便，成本低，在提取高纯度杜仲叶总黄酮方法中具有一定的推广价值，大大提高了杜仲叶资源的利用率，拓宽了杜仲资源利用新思路。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制取高纯度杜仲叶总黄酮的分离富集方法，其特征在于，包括以下步骤；(1)将干燥后的杜仲叶粉碎制成粗粉；(2)取适量粗粉加入第一溶剂后于80℃回流提取两次，每次提取1.5h，合并两次提取液，回收第一溶剂后得到杜仲叶总浸膏；(3)分离：取杜仲叶总浸膏用适量蒸馏水溶解混匀，过滤除去不溶物，加入到AB
‑
8大孔树脂层析柱中，先用蒸馏水洗去杂质，以70％～100％浓度的乙醇为流动相洗脱，收集醇洗脱液；(4)回收乙醇后，于鼓风干燥箱中干燥，研磨制成粉末Ⅰ；(5)富集：取少量粉末Ⅰ溶解于第二溶剂中，加入Sephadex LH
‑
20葡聚糖凝胶层析柱中，以55％～90％浓度的乙醇为流动相进行洗脱，每1/10柱体积收集一管洗脱液；(6)将洗脱液在鼓风干燥箱中分别干燥制成粉末，筛选其中纯度为70％以上的粉末进行合并，得到粉末Ⅱ，即为高纯度杜仲叶总黄酮。2.根据权利要求1所述的分离富集方法，其特征在于，在步骤(2)中，第一溶剂为60％浓度的乙醇溶液。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文栋，秦璟，何芝洲，贺思嵘，陈珂炜，朱海亮，陈鲲，
申请(专利权)人：湖北南博生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：