一种培育高赖氨酸优质蛋白玉米的方法技术

本发明专利技术公开了一种培育高赖氨酸优质蛋白玉米的方法，所述方法是将抑制α

【技术实现步骤摘要】
一种培育高赖氨酸优质蛋白玉米的方法
(一)

[0001]本专利技术属于植物分子生物学领域，特别是转基因作物品种培育领域。本专利技术涉及应用生物技术方法培育高赖氨酸的优质蛋白玉米的方法。
(二)
技术介绍

[0002]玉米(Zea mays)是世界上种植范围最广、产量最高的作物之一，是世界上很多地区的主要食物来源和饲料原料。玉米种子中总蛋白含量约占10％左右，玉米种子中的蛋白主要以贮藏蛋白的形式存在，贮藏蛋白分为四大类：溶于水的清蛋白，溶于盐溶液的球蛋白，溶于一定浓度乙醇的醇溶蛋白，以及溶于稀碱溶液的谷蛋白。其中，醇溶蛋白占贮藏蛋白总量的70％左右，醇溶蛋白中又以α
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醇溶蛋白含量最高，占醇溶蛋白总量的60％以上。赖氨酸常被称为“第一限制性氨基酸”，玉米醇蛋白里缺乏赖氨酸和色氨酸，导致蛋白质营养价值的贫乏。若以玉米作为单一的蛋白来源，往往会因为赖氨酸缺乏导致糙皮病。因此玉米作为饲料时，一般需要添加豆粕或赖氨酸来补充蛋白质和提高蛋白质吸收利用效率，一般每吨饲料需要添加150
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300公斤豆粕，500
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3000克赖氨酸，不同饲料对蛋白和赖氨酸添加需求量有一定差异，赖氨酸含量高的玉米可以减少豆粕和赖氨酸添加量。豆粕来源于大豆榨油后的残渣，主要依赖进口，近年来价格不断上涨，豆粕减量和替代是近年来饲料研究的主要工作之一。赖氨酸一般通过微生物发酵生产，生产成本较高。研究显示改良玉米贮藏蛋白组成比例，降低玉米醇溶蛋白含量，可以有效提高赖氨酸含量，能够减少豆粕使用量，有效提高玉米贮藏蛋白的吸收利用效率，降低饲料生产成本。
[0003]当前研究显示，玉米转录因子Opaque2对调控玉米醇溶蛋白的表达有重要作用，Opaque2缺陷型的玉米表现出醇溶蛋白表达量降低，赖氨酸和色氨酸表达量大幅度提高，玉米具有更好的营养价值，因此Opaque2缺陷型玉米被作为种质资源应用于玉米优质蛋白玉米品种培育。通过RNAi或基因编辑的方法抑制玉米籽粒α
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醇溶蛋白的表达也可以有效提高籽粒中赖氨酸含量获得优质蛋白玉米，但是醇溶蛋白在玉米蛋白体和角质的形成中起到关键作用，低表达α
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醇溶蛋白的玉米常常伴随着籽粒变成粉粒，在种植过程中籽粒容易的粒腐病，影响玉米品质，在机器收割和脱粒过程中籽粒容易破碎。单纯抑制玉米籽粒醇溶蛋白的表达虽然可以获得高赖氨酸的优质蛋白玉米，但是影响玉米籽粒角质层正常形成，该问题限制了Opaque2缺陷型的玉米和RNAi抑制醇溶蛋白玉米的应用。
(三)
技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种培育高赖氨酸优质蛋白玉米的方法，利用生物技术方法抑制玉米籽粒中α
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醇溶蛋白表达的同时表达融合高赖氨酸残基的γ
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醇溶蛋白融合基因，从而获得高赖氨酸、能够形成玉米角质层的优质蛋白的硬粒玉米，作为饲料使用时，可以减少蛋白和赖氨酸添加量，降低饲料成本。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]本专利技术提供一种培育高赖氨酸优质蛋白玉米的方法，所述方法是将抑制α
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醇溶蛋
白表达的RNAi干扰表达框和高赖氨酸融合基因表达框转入玉米基因组，培育获得优质蛋白玉米；所述RNAi干扰表达框包括RNAi干扰序列，所述RNAi干扰序列以SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示α
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醇溶蛋白编码基因为靶标；所述高赖氨酸融合基因表达框包括富含赖氨酸残基的γ
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醇溶蛋白融合基因，所述富含赖氨酸残基的γ
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醇溶蛋白融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0007]优选的，所述RNAi干扰表达框包括RNAi干扰序列、种子特异启动子和终止子；所述种子特异启动子为玉米22kDα
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醇溶蛋白启动子，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；所述终止子核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
[0008]优选的，所述RNAi干扰序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
[0009]优选的，所述高赖氨酸融合基因表达框包括富含赖氨酸残基的γ
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醇溶蛋白融合基因、启动子和终止子；所述启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.9，所述终止子核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
[0010]优选的，所述方法还包括将耐草甘膦表达框转入玉米基因组，用于筛选阳性转化子，所述耐草甘膦表达框核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0011]与现有方法相比，本专利技术的有益效果主要体现在：现有高赖氨酸优质蛋白玉米的培育主要应用Opaque2缺陷型玉米或者RNA干扰法抑制α
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醇溶蛋白的表达，α
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醇溶蛋白在玉米蛋白体和角质的形成中起到关键作用，单纯降低α
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醇溶蛋白表达可以提高赖氨酸和色氨酸含量，但是得到的玉米常常因为籽粒不能形成正常的角质层，籽粒成为粉粒。在种植过程中粉粒玉米容易得粒腐病，在脱粒过程中粉粒玉米容易破碎，影响玉米品质。本专利技术在抑制玉米α
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醇溶蛋白表达的同时还特异性表达富含赖氨酸残基的γ
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醇溶蛋白融合基因，γ
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醇溶蛋白的增量表达能够促进玉米角质层的形成，获得角质层正常的硬粒优质的玉米，赖氨酸含量达0.41％。
(四)附图说明
[0012]图1、转化载体CP4
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RNAi图谱。
[0013]图2、转化载体CP4
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RNAi
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Gam图谱。
[0014]图3、转化体阳性分子凝胶电泳图；+：载体对照；
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：常规玉米；1
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4：RK四个转化体；5
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8：HRK四个转化体。
[0015]图4、籽粒蛋白及种子对比(CK：常规种子蛋白电泳及种子剖切面，种子正常角质化；RK7：RK转化体只含有RNAi片段，种子醇溶蛋白电泳图及种子剖切面，种子不能正常角质化；HRK16：HRK转化体，含有γ
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醇溶蛋白融合蛋白，种子醇溶蛋白电泳图及种子剖切面，种子正常角质化)。
(五)具体实施方式
[0016]下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：
[0017]实施例1：玉米转化质粒载体的获得
[0018]本专利技术用于玉米转化的质粒载体以pCambia1300(GenBank:AF234296.1)为植物转化载体框架，在其多克隆位点区域加入包含完整抗草甘膦表达框(SEQ ID NO.8)和RNAi干
扰表达框，获得抑制α
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醇溶蛋白的表达载体CP4
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RNAi(载体图谱如图1所示)。再在转化载体CP4
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RNAi上加入γ
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醇溶蛋白融合基因表达框，获得表达载体CP4
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RNAi...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培育高赖氨酸优质蛋白玉米的方法，其特征在于，所述方法是将抑制α
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醇溶蛋白表达的RNAi干扰表达框和高赖氨酸融合基因表达框转入玉米基因组，培育获得优质蛋白玉米。2.如权利要求1所述培育高赖氨酸优质蛋白玉米的方法，其特征在于，所述RNAi干扰表达框包括RNAi干扰序列，所述RNAi干扰序列以SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示α
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醇溶蛋白编码基因为靶标。3.如权利要求1所述培育高赖氨酸优质蛋白玉米的方法，其特征在于，所述高赖氨酸融合基因表达框包括富含赖氨酸残基的γ
‑‑
醇溶蛋白融合基因，所述富含赖氨酸残基的γ
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醇溶蛋白融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。4.如权利要求1或2所述培育高赖氨酸优质蛋白玉米的方法，其特征在于，所述RNAi干扰表达框包括RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：林朝阳，赵宇，佘明君，李嘉婕，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：