一种间充质干细胞无血清冻存液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种间充质干细胞无血清冻存液及其制备方法。所述冻存液的原料包括平衡盐溶液、糖类、冷冻保护剂、抗细胞凋亡剂，pH为7.0～7.2，且不含有胎牛血清。所述冻存液排除了胎牛血清这一种多源动物血清，避免了冻存液对被保存的细胞的污染风险，使得冻存的细胞可以长期使用同一种冻存液而不影响其后续使用。期使用同一种冻存液而不影响其后续使用。期使用同一种冻存液而不影响其后续使用。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞无血清冻存液及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物样品保存试剂
，具体涉及一种间充质干细胞无血清冻存液及其制备方法。

技术介绍

[0002]干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的多能细胞。其中脐带间充质干细胞(UC
‑
MSC)来源于脐带外层通胶，具有多种因子和外泌体分泌能力，可以有效抑制慢性炎症，促进损伤组织修复并改善微循环血管功能。它可以实现对多种组织代偿性修复，具有广阔的临床应用前景。干细胞移植或干细胞治疗视目前最广为人知的干细胞治疗方式。
[0003]传统中的脐带间充质干细胞的保存方法为超低温冻存，利用冻存技术将细胞置于
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196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，起到细胞保种的作用。
[0004]现有技术中多使用的含有胎牛血清和二甲基亚砜(DMSO)，作为冻存液主要成分。但胎牛血清本身就是多源动物血清，对细胞存在有污染的可能，长期使用影响细胞活性，后续使用影响细胞临床治疗推广。而DMSO其具有抗冻作用，但是其具有明显的细胞毒性，会对冻存细胞造成损伤，并且对于细胞临床治疗带来毒性异物，不利于临床的使用与推广。
[0005]目前现有的很多干细胞冻存液要么使用胎牛血清，要么使用DMSO，即使不含有胎牛血清或DMSO，但其冻存的效果不理想，存在长时间保存细胞复苏率差，存活率低等问题，极大地限制了其在临床上的推广应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种间充质干细胞无血清冻存液及其制备方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
[0007]本专利技术第一方面提供了一种冻存液。所述冻存液的原料包括平衡盐溶液、糖类、冷冻保护剂、抗细胞凋亡剂，pH为7.0～7.2，且不含有胎牛血清。所述冻存液排除了胎牛血清这一种多源动物血清，避免了冻存液对被保存的细胞的污染风险，使得冻存的细胞可以长期使用同一种冻存液而不影响其后续使用。
[0008]在本专利技术的一些实施方式中，所述平衡盐溶液选自Hank's平衡盐溶液、Earle's平衡盐溶液或磷酸盐平衡生理盐水。
[0009]在本专利技术的一些实施方式中，所述糖类包括二糖和多糖，所述二糖包括蔗糖、海藻糖或乳糖，所述多糖包括葡聚糖或淀粉。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述冷冻保护剂包括甘露醇、DMSO、甘油、丙二醇或乙二醇中的至少一种。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述抗细胞凋亡剂包括维生素、维生素衍生物和/或谷胱甘肽。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述平衡盐溶液选自Hank's平衡盐溶液；所述糖类
选自α
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乳糖和葡聚糖
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40；所述冷冻保护剂选自甘露醇和DMSO；所述抗细胞凋亡剂选自水溶性维生素和谷胱甘肽。
[0013]进一步优选的实施方式中，所述α
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乳糖的浓度为50～100mM/mL，所述葡聚糖
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40的浓度为20～30％，所述甘露醇的浓度为0.3～0.5M/mL，所述DMSO的浓度为5～8％，所述谷胱甘肽的浓度为0.5～1.0μM/mL，所述水溶性维生素的浓度为0.1～0.2μM/mL。通过添加高浓度的葡聚糖
‑
40，形成一个有效的细胞渗透压缓冲体系，保证细胞的渗透压平衡；再结合适量的α
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乳糖和甘露醇等非渗透压保护剂结合，让冻存液形成一个有效的细胞外保护体系，提升细胞活率。虽然没有完全去除DMSO，但是5～8％的低含量使得其对被保存细胞的毒性降至极低；结合谷胱甘肽和水溶性维生素，可使冻存液有效降低自由基对被保存细胞的影响，提升细胞冻存后的复苏效果。
[0014]本专利技术第二方面提供了所述冻存液的制备方法。所述制备方法包括：向平衡盐溶液中加入糖类、冷冻保护剂、抗细胞凋亡剂后混匀；使用pH调节剂将pH调节为7.0～7.2。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述pH调节剂为碳酸氢钠。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述制备方法具体包括：
[0017]1)将葡聚糖
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40溶于HBSS溶液，配制成20～30％的葡聚糖溶液；
[0018]2)称取乳糖酸钠添加到上述配制成葡聚糖溶液配制成浓度为10M的α
‑
乳糖溶液；
[0019]3)称取甘露醇添加到上述配制成葡聚糖溶液配制成浓度为10M的甘露醇溶液；
[0020]4)称取谷胱甘肽添加到上述配制成葡聚糖溶液配制成浓度为10mM的谷胱甘肽溶液；
[0021]5)称取水溶性维生素添加到上述配制成葡聚糖溶液配制成浓度为1mM的维生素溶液；
[0022]6)称取α
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乳糖溶液1mL、甘露醇溶液5mL、谷胱甘肽溶液1mL、维生素溶液5mL，添加到上述配制成葡聚糖溶液并定容至100mL，再加入碳酸氢钠将pH调节为7.0～7.2，过滤除菌后，制备成成品。
[0023]本专利技术第三方面提供了所述冻存液在保存间充质干细胞中的应用。
附图说明
[0024]图1为实施例4中配方J冻存细胞复苏照片；
[0025]图2为实施例4中配方K冻存细胞复苏照片。
具体实施方式
[0026]以下实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0027]实施例1、脐带间充质干细胞的获取
[0028]1)在超净台内取出脐带，洗涤干净后剔除脐带外膜及动静脉管，只保留华通氏胶体，将华通氏胶体剪成1～2cm的小段，加入生理盐水后，用剪刀剪碎，离心后弃上清，将组织置于60cm2的培养皿中待其贴壁加入脐带间充质干细胞培养基，置于37℃、5％的CO2细胞培养箱中培养。
[0029]2)将脐带组织培养2～3天后进行半量换液，培养至第5天时，组织块周边有脐带间充质干细胞出现，标记为P0代，进行全换液处理；
[0030]3)培养至第7天后细胞融合度达到90％左右，弃去脐带组织块和原有培养液，生理盐水洗涤后加入0.25％的胰酶消化；
[0031]4)将上述消化液过滤后离心处理，加入新鲜培养基重悬细胞，细胞浓度为1
×
104个/mL，按照1:3的比例进行传代培养。
[0032]5)重复传代培养步骤至P3代，取对数生长期的脐带间充质干细胞进行冻存。
[0033]将处于对数生长期的P3代脐带间充质干细胞用0.25％胰酶
‑
EDTA消化后加入基础培养基终止消化，800rpm离心5min后加入PBS洗涤细胞两次，细胞汇总后按每份脐带间充质干细胞的浓度2.0
×
105个/mL进行分装。
[0034]实施例2、冻存液的原料种类优化试验
[0035]试验方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种冻存液，其特征在于，原料包括平衡盐溶液、糖类、冷冻保护剂、抗细胞凋亡剂，pH为7.0～7.2，且不含有胎牛血清。2.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述平衡盐溶液选自Hank's平衡盐溶液、Earle's平衡盐溶液或磷酸盐平衡生理盐水。3.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述糖类包括二糖和多糖，所述二糖包括蔗糖、海藻糖或乳糖，所述多糖包括葡聚糖或淀粉。4.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂包括甘露醇、二甲基亚砜、甘油、丙二醇或乙二醇中的至少一种。5.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述抗细胞凋亡剂包括维生素、维生素衍生物和/或谷胱甘肽。6.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述平衡盐溶液选自Hank's平衡盐溶液；所述糖类选自α
‑
乳糖和葡聚糖
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵蓝，黄源坚，刘锐，魏鲁宁，
申请(专利权)人：中科东方细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：