一种与绵羊体尺相关的分子标记、其检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种与绵羊体尺相关的分子标记、其检测方法及应用。本发明专利技术通过对绵羊AGO2基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段的第306位、存在一个C/A多态性位点，进一步使用KASPar引物对1276只绵羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与生长性状进行关联分析，最终确定了本发明专利技术扩增的AGO2基因片段可以作为与绵羊体尺相关的分子标记。本发明专利技术通过检测分子标记，选留CC纯合的绵羊进入核心群，以提高绵羊的体尺性状，有助于增加经济效益。于增加经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种与绵羊体尺相关的分子标记、其检测方法及应用


[0001]本专利技术属于分子标记的
，具体涉及AGO2基因片段作为影响绵羊体尺的分子标记、其检测方法及应用。

技术介绍

[0002]湖羊是著名的多产品种，四级发情，生长快，性成熟早等优秀性状(X.Feng et al，2018)。湖羊主要分布在江苏、浙江和上海。错义突变发生在编码区，导致翻译缺陷蛋白，并与许多疾病有关(Lee et al.，2008)。同义突变在非编码区域并不产生改变的蛋白质，而是改变DNA和RNA序列，有被视为沉默突变，因此很容易被忽略(Sharma et al.)。然而，同义突变可以改变mRNA的稳定性、剪接调节位点、miRNA结合位点或翻译效率，从而导致蛋白质水平或蛋白质构象的改变(Sauna&Kimchi
‑
Sarfaty，2011)。
[0003]Argonaute RISC催化组分2(AGO2)是RNA诱导沉默复合物的主要组分。人类AGO家族包括四种不同的人类蛋白质：AGO1、AGO2、AGO3和AGO4(J et al，2008年)。虽然它们有很强的同源性，但已经证明只有AGO2具有翻译后修饰的效果。它不仅可以维持miRNA的稳态(Chen et al，2021)，还可以在一定程度上改变miRNA的活性(Zhang et al，2019年)。AGO2基因在体内广泛表达。视网膜中AGO2的破坏将导致视网膜变性(Chen et al，2021)。肝脏中的AGO2会影响小鼠的能量代谢、脂质代谢和糖代谢功能，进而影响小鼠的肥胖和脂肪沉积(Zhang，2018)。因此可以认为AGO2在生物发育中起着不可或缺的作用。AGO2基因虽然在现有研究中证实与脂肪的沉积相关，但是在生产实践中并没有明确地证明该基因能够改变绵羊的生长性状。
[0004]因此，为研究影响绵羊体尺生长的分子调控机制，寻找与体尺相关的分子标记，本专利技术分析了AGO2基因对绵羊部分体尺性状的影响，以促进绵羊朝向高生长性状方向的选育，为高生长性状肉羊的育种提供依据，具有重要的理论价值和现实意义。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种作为与绵羊体尺(绵羊胸围与管围)相关的分子标记及其应用。本专利技术的分子标记是从绵羊AGO2基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过扩增绵羊AGO2基因的DNA序列并测序，寻找AGO2基因的多态性位点，分析不同的基因型与绵羊体尺相关性，并建立含多态性位点的分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于培育快速生长的绵羊新品种中。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0007]本专利技术一方面提供了一种与绵羊体尺相关的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第306bp位的M表示C或A，由于上述序列在第306位碱基处有一个C/A突变，从而导致了绵羊AGO2基因在该位点的C/A多态性。
[0008]本专利技术的第二方面提供了一种检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增本专利技术上述分子标记或包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，
优选地，所述检测上述分子标记的引物对包括上游引物M
‑
F和下游引物M
‑
R，上游引物M
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物M
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]本专利技术的第三方面提供了一种检测上述分子标记的KASPar引物对，其包括检测AlleleC的正向引物A1、检测AlleleA的正向引物A2和通用引物C，所述检测AlleleC的正向引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述检测AlleleA的正向引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述通用引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0010]本专利技术的第四方面提供了一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了检测上述分子标记的PCR引物对或KASPar引物对。
[0011]本专利技术的第五方面提供了一种检测与绵羊体尺相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第306bp位的M表示C或A，所述方法包括利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
[0012]a)使用上述的引物对、KASPar引物对或包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组DNA进行扩增；
[0013]b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。
[0014]其中，在步骤b)中，上述分型鉴定的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。
[0015]利用上述引物对检测与绵羊体尺相关分子标记的方法，包括如下步骤：
[0016]a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；
[0017]b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
[0018]本专利技术的第六方面提供了如上述所述的分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊体尺性状检测中的应用，通过在待测绵羊的基因组DNA中检测本专利技术的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊体尺的高低，进而筛选出低快速生长型的绵羊。
[0019]如上所述的分子标记、引物对或试剂盒的检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用上述的引物对或试剂盒对绵羊的基因组DNA中进行扩增和检测，确定待测样品的AGO2基因的基因型，从而可以从中选育出快速生长的绵羊品种。
[0020]寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。
[0021]本专利技术通过对绵羊代表品种湖羊的AGO2基因进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第306位存在一个C/A多态性位点，并通过检测1276只绵羊多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊体尺相关的分子标记，该分子标记可以用于快速生长型绵羊的选育，为绵羊体尺的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。本专利技术通过设计竞争性等位基因特异性PCR(KASP)所需的KASPar引物对上述分子标记进行检测，该检测方法不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，并具有较高的准确性，为本专利技术的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。
[0022]本专利技术的有益效果在于：
[0023]本专利技术提供了影响绵羊体尺性状的分子标记及其C/A的多态性位点，通过测定该多态性的基因型来有效鉴别是否为体尺型的绵羊，为体型快速本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与绵羊体尺性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第306bp处的M表示C或A，该突变导致分子标记的C/A多态性。2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对，其特征在于，其包括上游引物M
‑
F和下游引物M
‑
R，上游引物M
‑
F的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，下游引物M
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，其包括检测AlleleC的正向引物A1、检测AlleleA的正向引物A2和通用引物C，所述检测AlleleC的正向引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述检测AlleleA的正向引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述通用引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。4.一种检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2的PCR引物对或权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小雪，刘佳，李发弟，王维民，张德印，李晓龙，赵源，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：