一种糖苷酶家族43的β-糖苷酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种糖苷酶家族43的β

【技术实现步骤摘要】
一种糖苷酶家族43的
β
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糖苷酶及其编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及一种糖苷酶家族43的β
‑
糖苷酶及其编码基因与应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]酶法催化反应具有高效、特异、绿色环保等优点，广泛应用于制药、食品、化妆品、农业、环境保护和能源生产等领域。糖苷酶(EC3.2.1)是生物体内重要的糖苷水解酶，在体外还能用于催化合成反应。糖类分子由于具有多个可以反应的羟基，使得化学法合成过程比较复杂，需要多步的基团保护和去保护作用，才能实现特定糖苷键的合成，而酶法合成具有立体选择性和区域选择性，能够一步合成糖苷产物，步骤简单，适合于规模化合成反应。
[0003]含β
‑
半乳糖苷键的具有重要功能的低聚半乳糖和半乳糖苷可由β
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半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)催化合成。β
‑
半乳糖苷酶是一类重要的糖苷水解酶，按照氨基酸和结构的同源性归属于GH1、GH2、GH35、GH42、GH59、GH147。该类酶具有β
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半乳糖苷键的水解活性，当以乳糖为底物时，水解底物释放出葡萄糖和半乳糖，该特性已被用于食品工业降解乳糖来改善乳制品的甜度、溶解性以及消化率，缓解人群中乳糖不耐受的症状。此外，装配有β
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半乳糖苷酶的生物传感器，可用于检测乳制品中的乳糖含量。除了水解活性，有的来源的β
‑
半乳糖苷酶还具有转糖基活性，能够以乳糖或硝基苯
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>β
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半乳糖苷为糖基供体，催化半乳糖基从糖基供体底物上转移到受体分子上，形成新的β
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半乳糖苷键，合成食品、药品及化妆品行业重要的寡糖及糖苷化合物。
[0004]β
‑
半乳糖苷酶通过双置换机制催化反应，酶分子两个关键氨基酸如谷氨酸在催化过程中发挥着至关重要的作用，一个作为酸/碱催化剂，另一个作为亲核体。反应第一步是酶的半乳糖基化，亲核体羧基直接作用于底物，形成共价键的糖基
‑
酶中间物，酸碱羧基先进行酸催化，提供质子，促进底物离去基团离去。反应第二步是酶的去糖基化，酸碱羧基再进行碱催化，激活受体分子，发生以水为受体的水解反应和以糖为受体的糖苷合成反应。该反应如果以乳糖为底物分子，则会发生水解反应；具有转糖基活性的酶还能以水解产物即葡萄糖、半乳糖及乳糖底物自身为受体合成重要的益生元——β
‑
低聚半乳糖；若以乳糖为糖基供体，其他羟基化合物为受体，则合成其他寡糖或糖苷。
[0005]值得注意的是，上述β
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低聚半乳糖的合成反应，存在乳糖水解副反应生成葡萄糖和半乳糖，其中葡萄糖的存在不利于糖尿病患者使用；对于采用乳糖或硝基苯半乳糖为糖基供体、羟基化合物为受体的转糖基反应，同样存在糖基供体的水解副产物，导致产物纯化复杂，高纯度半乳寡糖和糖苷的获得比较困难，在一定程度上限制了半乳糖苷产物在生物、医药领域的应用。因而，挖掘新的能以半乳糖为糖基供体合成β
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糖苷键的糖苷酶具有重要意义，由于单糖与糖基受体直接发生糖苷合成反应，因而不存在以双糖及糖苷为糖基供体的水解副反应。
[0006]目前，现有技术中没有糖苷酶家族43(GH43)具有合成β
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半乳糖苷键活性的报道。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种糖苷酶家族43的β
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糖苷酶及其编码基因与应用。
[0008]本专利技术的技术方案如下：
[0009]一种糖苷酶家族43的β
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糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010]上述糖苷酶家族43的β
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糖苷酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]根据本专利技术优选的，所述编码基因来源于山东泰安土壤宏基因组。
[0012]一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述糖苷酶家族43的β
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糖苷酶的编码基因。
[0013]根据本专利技术优选的，所述表达载体为pET
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21b表达载体。
[0014]一种重组细胞，在宿主细胞中转入了含有上述糖苷酶家族43的β
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糖苷酶的编码基因的载体。
[0015]根据本专利技术优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0016]利用上述β
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糖苷酶的核苷酸序列制备重组β
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糖苷酶的方法，步骤如下：
[0017](1)将β
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糖苷酶的基因序列SEQ ID No.1克隆到大肠杆菌表达载体pET
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21b中，构建重组表达载体pET
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ebg
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39308，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用氨苄青霉素抗性筛选出含β
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糖苷酶的重组菌株；
[0018](2)将步骤(1)筛选出的重组菌株接种于LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养过夜，获得种子液；将种子液以体积比0.5～1.5％的量接种于LB液体培养基中，待生长到OD600为0.6时，加入终浓度1mM的IPTG诱导，诱导温度为37℃，诱导时间为5h；
[0019](3)收集步骤(2)诱导后获得的菌细胞，超声破碎后，离心所得包涵体沉淀即为重组β
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糖苷酶。
[0020]上述糖苷酶家族43的β
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糖苷酶在合成低聚半乳糖、烷基半乳糖苷、酪醇半乳糖苷中的应用。
[0021]本专利技术提供的上述β
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糖苷酶具有如下酶学性质：
[0022]β
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糖苷酶单亚基的分子量为37
±
5kDa；β
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糖苷酶对邻硝基苯
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷(o
‑
Nitrophenyl β
‑
D
‑
galactopyranoside,oNPG)适宜反应的温度为40～55℃，适宜反应的pH为7.0～10.0；在25～50℃范围内保温2h，能够保留80％以上的活性；在pH 7.0～8.0的范围内4℃保存2h可以保留80％以上的活性；酶对邻硝基苯
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β
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷的K
m
值为0.64mM。
[0023]有益效果
[0024]1、本专利技术提供了一种新型GH43的β
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糖苷酶基因，并通过高效重组表达提供了大量的β
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糖苷酶，为低聚半乳糖、烷基半乳糖苷、酪醇半乳糖苷等产品的合成提供了新的工具酶。
[0025]2、本专利技术将β
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糖苷酶基因克隆到pET
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖苷酶家族43的β
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糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.权利要求1所述的糖苷酶家族43的β
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糖苷酶的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因来源于山东泰安土壤宏基因组。4.一种重组表达载体，其特征在于，在表达载体中插入了权利要求2所述的糖苷酶家族43的β
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糖苷酶的编码基因。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET
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21b表达载体。6.一种重组细胞，其特征在于，在宿主细胞中转入了权利要求4所述的重组表达载体。7.如权利要求6重组细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。8.利用权利要求2所述的β
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糖苷酶的核苷酸序列制备重组β
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糖苷酶的方法，其特征在于，步骤如...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢丽丽，张敬文，段飞宇，玄泽慧，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：