一种检测土壤中烟草靶斑病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测土壤中烟草靶斑病菌的方法，包括如下步骤：S1,通过PDA对烟草靶斑病菌YC

【技术实现步骤摘要】
一种检测土壤中烟草靶斑病菌的方法


[0001]本专利技术涉及土壤检测
，尤其涉及一种检测土壤中烟草靶斑病菌的方法。

技术介绍

[0002]烟草靶斑病(tobaccotargetspot)最早在巴西发现，随后在巴西的哥斯达黎加发现烟草靶斑病并鉴定其为瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris(Frank)Donk)引起。随着烟草靶斑病不断扩展，1985年该病在美国卡莱罗纳州大爆发烟草损失达2000万美元。1990年，南非、意大利等国家相继出现烟草靶斑病的相关报道。2006年中国首次发现烟草靶斑病，该病主要在东北烟草种植地区发生。随着国内烟草靶斑病蔓延，2020年贵州、四川等多地已发现烟草靶斑病，危害程度不断加深。
[0003]作为土传病原真菌的R.solani主要危害植株的根部、种子等近地部，但其也可危害植物地上部，如叶片、茎秆等。丝核菌常以菌丝或菌核作为初侵染来源，也有少部分病害以担孢子作为传播初侵染来源，其中烟草靶斑病菌R.solaniAG
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3主要以菌丝或担孢子作为传播的初侵染来源。烟草靶斑病菌作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测土壤中烟草靶斑病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1,通过PDA对烟草靶斑病菌YC
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9进行扩繁；S2，烟草靶斑病菌DNA的提取；S3，利用real
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time PCR定量检测接种烟草；S4，利用土壤DNA提取试剂盒对土壤中DNA进行提取；S5，土壤real
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time PCR扩增；S6，土壤中烟草靶斑病菌动态变化的监测。2.根据权利要求1所述的一种检测土壤中烟草靶斑病菌的方法，其特征在于,所述PDA对烟草靶斑病菌YC
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9进行扩繁包括：YC
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9及LF
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2菌株和于平板上活化28℃培养后，用打孔器打取菌丝圆片备用。分别于烟草9叶期第5和第6叶，清水冲洗后于0.5％次氯酸钠溶液中浸洗10s，用灭菌滤纸吸干，将叶片置于湿润灭菌滤纸上瞭干以去除残余次氯酸钠，分别将YC
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9和LF
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2菌饼置于叶片上，每张叶片针刺伤口接种4个菌饼。接种后，测量病斑直径，采用软件分析病斑。3.根据权利要求2所述的一种检测土壤中烟草靶斑病菌的方法，其特征在于，所述烟草靶斑病菌DNA的提取包括：取上述接种的病斑组织约加液氮迅速研磨成粉并转入的灭菌离心管中，釆用植物型提取试剂盒提取，1％琼脂糖电泳检测降解情况，并用微量紫外分光光度计检测浓度。4.根据权利要求3所述的一种检测土壤中烟草靶斑病菌的方法，其特征在于，所述利用real
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time PCR定量检测接种烟草包括：标准曲线制作以及real
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time PCR检测；其中标准曲线制作采用上述烟草勒斑病菌构建的质粒，利用Nanodrop
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ND
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1000测定质粒的浓度和纯度，经测序后获得正确插入外源片段的质粒即为标准品；采用绝对定量检测来定量离体叶片中的烟草斑病菌的数量，采用11ng/μL YC
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9作为母液进行10倍体积稀释，共计5个浓度梯度，分别是11ng/μL、1.1ng/μL、110pg/μL和11pg/μL；real
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time PCR检测为每个样品重复3次反应，采用反应体系：real
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time PCR2.5
×
Buffer 8μL，上游引物(10μM)0.2μL，下游引物(10μM)0.2μL，探针(10μM)0.4μL，Enhance 1μL，去离子水9.4μL，模板1μL，共计20μL。real
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time PCR反应在Aglient strategene上进行，反应程序为：95℃预变性20min；95℃20s，60℃30s...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪汉成，蔡刘体，孟建玉，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：