GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用制造技术

本发明专利技术公开GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用，属于生物技术应用领域。本发明专利技术涉及的GhLPL2基因，其编码一个溶血磷脂酶。本发明专利技术提供了GhLPL2在异源四倍体陆地棉品种军棉1号中A亚组、D亚组中全长ORF核苷酸序列和氨基酸序列。棉花GhLPL2与黄萎病菌毒蛋白VdNLP1互作并参与棉花黄萎病抗性。该基因在棉花所有组织中均有表达，受黄萎病菌诱导显著上调表达。GhLPL2是棉花生长发育关键基因，在棉花中敲除该基因影响植株糖代谢及磷脂代谢过程，显著干扰植株生长发育，不能产生后代。将该基因在棉花中过量表达抑制VdNLP1的毒力并激活免疫反应，显著提高植株抗病性，但不影响植株正常生长发育。株正常生长发育。株正常生长发育。

【技术实现步骤摘要】
GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用


[0001]本专利技术属于生物技术应用领域，涉及棉花GhLPL2基因在提高棉花黄萎病抗病性中的应用，该基因编码一个溶血磷脂酶。通过对黄萎病菌中的毒蛋白VdNLP1进行系统分析及克隆，利用构建的受黄萎病菌VD8诱导陆地棉品种军棉1号根部酵母表达文库进行互作蛋白筛选，进一步进行基因全长序列克隆及互作验证，结合转基因验证及分子机理解析，明确棉花中GhLPL2与黄萎病菌毒蛋白VdNLP1互作并参与棉花黄萎病抗性。棉花中GhLPL2基因保守，在四倍体棉花中存在2个拷贝，A、D亚组各一个。该基因在所有组织中均有表达，受黄萎病菌诱导显著上调表达。利用PCR技术在陆地棉品种军棉1号中获得该基因的全长ORF序列及编码的氨基酸序列。利用生物技术对该基因参与的植物抗病性以及功能机制进行了具体的研究，GhLPL2是棉花生长发育关键基因，在棉花中敲除该基因影响植株糖代谢及磷脂代谢过程，显著干扰植株生长发育，不能产生后代。将该基因在棉花中过量表达抑制VdNLP1的毒力并激活免疫反应，显著提高植株抗病性，但不影响植株正常生长发育。

技术介绍

[0002]黄萎病菌为一种土传的半活体营养型真菌，其可以侵染200多种双子叶植物，其中包括棉花、番茄、黄瓜、辣椒、茄子和马铃薯等主要的经济作物，具有寄主范围广泛、传播速度快及土壤中存活时间久等特点，在田间难以防治(Bhat and Subbarao,1999)。棉花是世界上重要的经济作物，也是主要的战略物资，在我国国民经济中占有不可取代的地位。然而，在新疆等主要棉花种植区，由大丽轮枝菌引发的黄萎病病情严重，危害棉花的产量和品质，是目前威胁我国棉花可持续生产的主要障碍之一。自1914年美国首次发现棉花黄萎病后，以极快的速度蔓延至其它主要棉花种植国；1935年，随美国种质资源的引入传入中国并逐年传播扩散，造成大面积的流行及减产(林玲等，2014；喻树迅，2018)。针对黄萎病害化学防治策略并不理想，田间轮作等管理手段也只能适当缓解病害的发生，挖掘棉花中关键抗病基因并创制抗病材料是提高抗病性最直接和有效的策略。
[0003]黄萎病菌的生活周期从微菌核的萌发开始，当感知到植物根部所释放的分泌物为信号后，微菌核开始产生胚芽管，并沿根表皮细胞纵向延伸。其中少量的菌丝顶端膨胀肿大，以附着枝的形式紧紧吸附在根表面，形成狭小的侵染钉结构穿透表皮进行侵染；在侵染的过程中，病原菌将分泌一些胶状物使其附着枝牢牢固定在侵染界面，用以承受穿透瞬间所产生的后座力；同时释放大量的细胞壁水解酶，如果胶酶、角质酶及纤维素酶等，破坏植物细胞壁组织(Sesma and Osbourn,2004；Zhao et al.,2014；Zhao et al.,2016)；大量效应因子破坏或干扰植物的免疫反应(de Jonge et al.,2011)。成功侵入后的菌丝逐渐向中心位置蔓延，最终进入木质部并定殖，在细胞内或细胞间生长繁殖，并顺着木质部导管向上扩展至茎部或叶部(Shaban et al.,2018)。
[0004]深入探究黄萎病菌的致病机理将有助于推动棉花抗病分子育种的发展进程。“堵塞学说
””
和“毒素学说”是目前两种黄萎病菌引起发病的主流假说。当菌丝和孢子在导管中大量繁殖，会激活邻近的薄壁细胞产生胶状物和侵填体，堵塞导管并影响水分的运输，最终
et al.,2020)。为了阻止VdSSEP1蛋白酶对棉花几丁质酶的降解，棉花进化出富含半胱氨酸重复序列的蛋白CRR1，保护几丁质酶不被破坏(Han et al.,2019)。结合黄萎病菌致病机制，进一步探究棉花的多层免疫系统，将是棉花抗病育种研究的重点。
[0007]坏死和乙烯诱导型蛋白NLP1(Necrosis
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and ethylene
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inducing peptide 1
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like proteins)是病原菌中鉴定的一类重要毒素成分，其广泛存在于植物病原真菌、细菌和卵菌中。自1995年，从被诱导的尖孢镰刀菌滤液中分离到第一个NLP1，原核表达纯化的蛋白能引起叶片的坏死并诱导乙烯合成，由此这类包含保守的坏死和乙烯诱导蛋白(NPP1)结构域的毒性蛋白被发现(Bailey,1995)。尽管NLPs分布广泛，但其在不同病原物体内的数量差异很大，卵菌的基因组中数量很多，每个菌种中都达到50
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60个。卵菌是感染双子叶植物的主要病原体，极具破坏性，NLP1的晶体结构分析明确了氨基酸D104及保守的七肽基序GHRHDWE是触发植物细胞质膜透化和胞质溶解的必要条件，揭示了NLPs对于膜损伤、诱导细胞死亡及促进毒力的特性，并提出NLP与宿主膜的互作模式。此外，NLP1引起的细胞死亡以及对宿主膜的独特作用需要宿主活跃的细胞代谢(Ottmann et al.,2014)。等(2017)鉴定到了NLP1在植物细胞膜的靶点，其并不是蛋白质，而是一种特异性的鞘脂
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糖基肌醇磷酸神经酰胺(GIPC)，NLP1靶向细胞膜双分子层的外叶并造成胞质溶解，整个过程中GIPC的完整性及有序的质膜环境是毒力所必需的；当GIPC途径被阻断后提高了植株对NLP1毒力的耐受性，然而植株表现为生长发育缺陷或无法生存。由于NLP1与GIPC单体的己糖残基部分结合，所以在单子叶和双子叶植物间GIPC己糖结合位点的差异导致其对NLP1的耐受性有所差异。
[0008]除了对细胞的毒力作用外，NLP1也作为激发子激活植物的系统性免疫响应。在拟南芥中异源表达卵菌的NLP1导致叶片局部坏死，同时伴随着宿主免疫反应的激活，包括乙烯、活性氧、胼胝质积累及抗病基因表达(Fellbrich,2002)；体外表达的NLP1蛋白同样也能诱导拟南芥的免疫反应，复杂的分子网络变化类似于模式分子Flg22所触发的免疫，包括RLK受体、抗病蛋白、PR基因、WRKY及抗病激素SA、ET等相关基因的诱导表达(Qutob et al.,2006)。据报道，NLP1含有保守的20个氨基酸残基(nlp20)，其可以作为模式分子被植物受体识别触发免疫应答。拟南芥中的富亮氨酸重复序列受体蛋白(LRR
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RLP)RLP23识别多数NLP1中的nlp20，并与AtSOBIR1形成复合物后招募另一个(LRR
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RLK)AtBAK1配体结合生成三联复合物介导免疫反应激活。将RLP23在马铃薯中过量表达显著增强植株对破坏性病原卵菌和真菌的抗性(Albert et al.,2015)。NLP1诱导的这种免疫反应需要氨基酸的完整性，若N端或C端截断其作用将被抑制(Fellbrich et al.,2002)。
[0009]相比之下，真菌中的NLP基因较少，在黄萎病菌的基因组中只鉴定到8个，其中2个NLPs(VdNLP1和VdNLP2)具有细胞毒性(Zhou et al.,2012)。Wang等(2004)首次鉴定了黄萎病菌中VdNLP1蛋白，编码233个氨基酸，与卵菌中的NLP1蛋白具有高度的相似本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的GhLPL2基因在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。2.含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的GhLPL2基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：以所述的GhLPL2基因为靶基因，通过基因工程方法，过量表达GhLPL2基因，提高目标植物抗病性或培育抗病性提高的目标植物新种质并在生产上应用。4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于：所述的抗病性为黄萎病抗病性。5.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于：所述的目标植物为棉花或拟南芥。6.一种提高棉花抗黄萎病的方法，其特征在于：在棉花中过量表达核苷酸序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭旺珍，王桂林，王心宇，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：