受体偏向的PEG化IL-2变体组合及其应用制造技术

本发明专利技术涉及免疫治疗领域，具体地，本发明专利技术涉及定点修饰的PEG化IL

【技术实现步骤摘要】
受体偏向的PEG化IL
‑
2变体组合及其应用


[0001]本专利技术涉及免疫治疗领域，具体地，本专利技术涉及定点修饰的PEG化IL
‑
2变体，以提供具备不同受体偏向性的PEG化IL
‑
2变体的组合。本专利技术还提供了用于增强免疫应答、治疗增生性疾病如肿瘤的组合疗法，以及制备或培养用于过继性细胞治疗的免疫细胞的体外方法。

技术介绍

[0002]白细胞介素
‑
2(IL2)是一类重要的细胞因子，是B细胞、T细胞及NK细胞发育和功能所必须的细胞因子。IL2的受体分为IL2
‑
Rα单体，IL2
‑
Rβγ二聚体和IL2
‑
Rαβγ三聚体，其中IL2与α单体亲和力较弱为10
‑8M，与βγ二聚体亲和力中等为10
‑9M，与αβγ三聚体亲和力最高为10
‑
11
M。由于亲和力低，二聚体IL
‑
2R或内源性IL
‑
2都需要以高水平诱导才能产生“二聚体IL
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.组合物，其包含：(1)第一定点修饰的IL
‑
2，其与野生型IL
‑
2相比在第一氨基酸位置的残基包含PEG基团修饰，其中，所述第一定点修饰的IL
‑
2对IL
‑
2受体α(IL
‑
2Rα)亚基不结合或以大于1E
‑
8M(例如数量级为1E
‑
7～1E
‑
6M)的KD值结合；以及(2)第二定点修饰的IL
‑
2，其与野生型IL
‑
2相比在第二氨基酸位置的残基包含PEG基团修饰，其中，所述第二定点修饰的IL
‑
2对IL
‑
2受体β(IL
‑
2Rβ)亚基不结合。2.权利要求1所述的组合物，其中，所述第一定点修饰的IL
‑
2(i)以小于1E
‑
8M(例如数量级为1E
‑
9～1E
‑
8M)的KD值结合IL2
‑
Rβγ二聚体，和/或，(ii)对IL2
‑
Rαβγ三聚体不结合或以大于1E
‑
8(例如数量级为1E
‑
7～1E
‑
6)的KD值结合。3.权利要求1或2所述的组合物，其中，所述第二定点修饰的IL
‑
2(i)以小于1E
‑
8(例如数量级为1E
‑
9～1E
‑
8)的KD值结合IL2
‑
Rαβγ三聚体，和/或，(ii)对IL2
‑
Rβγ二聚体不结合。4.权利要求1
‑
3任一项所述的组合物，其中，所述第一氨基酸位置选自F42、Y45、E62、K64、P65、E68、K35、T37、R38、T41、K48、K49；优选地，所述第一氨基酸位置选自F42、Y45、E62、K64、P65、E68。5.权利要求1
‑
4任一项所述的组合物，其中，所述第二氨基酸位置选自H16、D20、A73、H79；优选地，所述第二氨基酸位置选自D20。6.权利要求1
‑
5任一项所述的组合物，其中，所述第一氨基酸位置为F42、Y45、E62、K64、P65或E68，所述第二氨基酸位置为D20；或者，所述第一氨基酸位置为Y45，所述第二氨基酸位置为H16、D20、A73、H79；优选地，所述第一氨基酸位置为Y45，所述第二氨基酸位置为D20。7.权利要求1
‑
6任一项所述的组合物，其中：(a)所述第一定点修饰的IL
‑
2包含的PEG修饰基团的平均分子量为5～60kDa，例如为5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa或60kDa；优选地，所述第一定点修饰的IL
‑
2包含的PEG修饰基团的平均分子量为5～40kDa，例如为5～30kDa、5～25kDa、5～20kDa、10～40kDa、10～30kDa、15～30kDa、10～25kDa或15～25kDa，例如为5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa或40kDa；和/或，(b)所述第二定点修饰的IL
‑
2包含的PEG修饰基团的平均分子量为5～60kDa，例如为5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa或60kDa；优选地，所述第二定点修饰的IL
‑
2包含的PEG修饰基团的平均分子量为5～40kDa，例如为5～30kDa、5～25kDa、5～20kDa、10～40kDa、10～30kDa、15～30kDa、10～25kDa或15～25kDa，例如为5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa或40kDa。8.权利要求1
‑
7任一项所述的组合物，其中，所述第一氨基酸位置的残基被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸上连接有所述PEG基团；和/或，所述第二氨基酸位置的残基被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸上连接有所述PEG基团。9.权利要求8所述的组合物，其中，所述非天然氨基酸含有化学官能基团(例如，羰基、炔基或叠氮基团)；所述PEG基团包含能与该化学官能基团发生化学反应的标记基团，从而
所述PEG基团连接至非天然氨基酸；优选地，所述非天然氨基酸含有叠氮基团，所述PEG基团包含能与叠氮基团发生click化学反应的标记基团，从而所述PEG基团连接至非天然氨基酸；优选地，所述能与叠氮基团发生click化学反应的标记基团为包含二苯并环辛炔基团的化学部分，例如DBCO、DIBO或BCN；优选地，所述非天然氨基酸为含有叠氮基团的赖氨酸衍生物或酪氨酸衍生物，例如Nε
‑2‑
叠氮乙氧羰基
‑
L
‑
赖氨酸(NAEK)或2
‑
amino
‑3‑
(4
‑
(azidomethyl)phenyl)propanoic acid。10.制备权利要求1
‑
9任一项所述的组合物的方法，其包括制备所述第一定点修饰的IL
‑
2和制备所述第二定点修饰的IL
‑
2，其中，制备所述第一定点修饰的IL
‑
2包括：
‑
提供：(a1)第一定点突变的IL
‑
2，其与野生型IL
‑
2相比在第一氨基酸位置的残基被突变为非天然氨基酸；(b1)由标记基团修饰的PEG基团，所述标记基团能与所述非天然氨基酸形成共价键；
‑
将(a1)与(b1)共孵育，通过化学反应将非天然氨基酸与PEG基团偶联；制备所述第二定点修饰的IL
‑
2包括：
‑
提供：(a2)第二定点突变的IL
‑
2，其与野生型IL
‑
2相比在第二氨基酸位置的残基被突变为非天然氨基酸；(b2)由标记基团修饰的PEG基团，所述标记基团能与所述非天然氨基酸形成共价键；
‑
将(a2)与(b2)共孵育，通过化学反应将非天然氨基酸与PEG基团偶联。11.权利要求10所述的方法，其中，(a1)中所述的非天然氨基酸含有化学官能基团(例如，羰基、炔基、叠氮基团)，(b1)中所述PEG基团包含的标记基团能与该化学官能团发生化学反应形成共价键；和/或，(a2)中所述的非天然氨基酸含有化学官能基团(例如，羰基、炔基、叠氮基团)；(b2)中所述PEG基团包含的标记基团能与该化学官能团发生化学反应形成共价键；优选地，(a1)和(a2)中所述的非天然氨基酸包含叠氮基团；优选地，(a1)和(a2)中所述的非天然氨基酸为包含叠氮基团的赖氨酸衍生物或酪氨酸衍生物，例如Nε
‑2‑
叠氮乙氧羰基
‑
L
‑
赖氨酸(NAEK)或2
‑
amino
‑3‑
(4
‑
(azidomethyl)phenyl)propanoic acid。12.权利要求10所述的方法，其中，所述制备所述第一定点修饰的IL
‑
2包括：
‑
提供：(a1)第一定点突变的IL
‑
2，其与野生型IL
‑
2相比在第一氨基酸位置的残基被突变为含有叠氮基团的非天然氨基酸；(b1)由标记基团修饰的PEG基团，所述标记基团能与叠氮基团发生click化学反应；
‑
将(a1)与(b1)共孵育，通过click反应将非天然氨基酸与PEG基团偶联；所述制备所述第二定点修饰的IL
‑
2包括：
‑
提供：(a2)第二定点突变的IL
‑
2，其与野生型IL
‑
2相比在第二氨基酸位置的残基被突变为含有叠氮基团的非天然氨基酸；(b2)由标记基团修饰的PEG基团，所述标记基团能与叠氮基团发生click化学反应；
‑
将(a2)与(b2)共孵育，通过click反应将非天然氨基酸与PEG基团偶联；优选地，所述click化学反应为无铜的click化学反应；优选地，所述能与叠氮基团发生click化学反应的标记基团为包含炔基的化学部分，例如包含二苯并环辛炔基团的化学部分，例如DBCO、DIBO或BCN；优选地，所述能与叠氮基团发生click化学反应的标记基团为DBCO。13.权利要求10
‑
12任一项所述的方法，其中，通过非天然氨基酸正交翻译技术提供所述第一定点突变的IL
‑
2和所述第二定点突变的IL
‑
2；优选地，所述非天然氨基酸正交翻译技术包括以下步骤：
‑
获得编码定点突变的IL
‑
2的核酸序列，其中，待突变氨基酸位置对应的密码子被突变为TAG；
‑
将所述编码定点突变的IL
‑
2的核酸序列与载体可操作地连接，得到定点突变序列表达载体；
‑
将所述定点突变序列表达载体与编码琥珀密码子抑制型tRNA和对非天然氨基酸特异性的氨酰tRNA合成酶的载体共转染宿主细胞，在含有非天然氨基酸的培养基中培养并诱导表达，得到定点突变为非天然氨基酸的IL
‑
2；优选地，所述非天然氨基酸为Nε
‑2‑
叠氮乙氧羰基
‑
L
‑
赖氨酸(NAEK)；优选地，所述对非天然氨基酸特异性的氨酰tRNA合成酶为NAEK特异性氨酰tRNA合成酶。14.试剂盒，其包含：权利要求1
‑
9任一项所述的组合物；优选地，所述试剂盒进一步包含包装说明书，所述包装说明书包含使用所述组合物来在体外制备和/或培养用于过继性细胞治疗的免疫细胞的说明；优选地，所述用于过继性细胞治疗的免疫细胞是经改造的免疫细胞，其表达嵌合抗原受体和/或包含编码所述嵌合抗原受体的核酸分子；优选地，所述嵌合抗原受体包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、以及一个或...

【专利技术属性】
技术研发人员：周德敏，纪德重，孙家琦，张博，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：