一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用，肠源枯草芽孢杆菌N65具备较好的抗逆性及抑菌、产酶等益生特性，具备开发为饲用抗生素替代类功能微生态制剂的潜力，为功能微生态制剂的差异化开发提供优良菌株资源。通过高温孵育、胆盐耐受及指示菌的对峙培养方法从健康猪肠道内容物中分离获得1株具有较强的产酶能力和广谱抑菌性能的菌株N65，形态学和16S rDNA分子鉴定确认其为枯草芽孢杆菌。其无菌发酵上清液的抑菌活性成分具备良好的温度、胆盐、pH及人工胃肠液的耐受性，溶血反应小，基本不具备溶血风险，展示了较为良好的生物学特性，为功能微生态制剂的差异化开发及应用提供了良好的菌株资源。及应用提供了良好的菌株资源。及应用提供了良好的菌株资源。

【技术实现步骤摘要】
一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及枯草芽孢杆菌的
，具体涉及一种肠源枯草芽孢杆菌株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]抗生素作为20世纪最重要的专利技术之一，对治疗人类疾病发挥了历史性的贡献，不仅挽救了数百万人的生命，延长了预期寿命，而且被广泛用作牲畜的生长补充剂，改善动物的整体健康状况，提高产量和质量，在实现畜牧业快速发展方面也做出了巨大贡献。然而，随着养殖业的发展，滥用和过度使用抗生素及其不当处置导致了一系列重大的健康和环境问题。抗生素不仅在肉产品及粪污中残留，影响动物生产及生态环境，还通过食物链传递，威胁人类健康，特别是微生物对抗生素耐药性的兴起与传播，引发全球性健康危机。考虑到其危害，世界各国政府与组织在对饲用抗生素的规范使用进行一些列部署的同时，也一直鼓励抗生素替代品的科学研究与开发。鉴于抗生素的肠道作用特点，新型抗生素的替代品至少应具备以下几个重要特征：1)调整肠道共生物微生物群落结构；2)保证动物肠道结构完整，促进营养物质吸收；3)维护肠道免疫系统稳态，保持动物健康度。这些作用互相关联，并且都与肠道健康直接相关，只要把关键的注意点放到促进动物的肠道健康上，就可以在不牺牲动物生产性能和健康的基础上减少抗生素的使用。
[0003]功能型微生态制剂作为替抗产品的典型代表之一，不仅作为“活的”益生菌，竞争占位及生物夺氧等方式抑制肠道内的病原微生物，帮助动物建立有利于宿主的肠道微生态区系。而且其相关功能代谢产物或副生产物，也称为后生元，还能够在动物肠道发挥作用，提高动物的抗病能力，从而促进动物生长，改善生产性能。枯草芽孢杆菌作为我国饲料添加剂目录(2021版)中允许使用的微生物饲料添加剂的一种，其生产要求简单，能形成抗逆性强的芽孢，环境耐受性强，利于保存和运输，而且具备丰富的产酶体系，活性代谢产物丰富。不仅可以产生抗菌活性成分，抑制致病菌在肠道中定植、维持肠道微生物区系平衡，而且分泌多种水解酶，改善消化道内环境、提高饲料利用率，还可以维护动物肠道免疫，增强动物的防病能力，已作为功能微生态制剂广泛应用于畜禽及水产养殖领域。但是不同来源的枯草芽孢杆菌的定植能力、代谢产物功能以及抗逆性差异大，大大限制了其在生产实践中的功能发挥。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种肠源枯草芽孢杆菌株，具有耐温、耐胆盐的效果，且具备分泌多种酶和抑菌活性；本专利技术的目的之二在于提供一种肠源枯草芽孢杆菌株的应用，该菌株能用于制备微生态制剂，能作为高效抗生素替代品；本专利技术的目的之三在于提供一种肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，从健康猪肠道内容物中定向分离筛选耐温、耐胆盐，且具备分泌多种酶和抑菌活性物质的功能型芽孢杆菌菌株。
[0005]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0006]一种肠源枯草芽孢杆菌株，所述肠源枯草芽孢杆菌株命名为枯草芽孢杆菌N65(Bacillus subtilis N65)，保藏号为GDMCC No:62369，保藏日期为2022年4月11日，保藏分类命名为枯草芽孢杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0007]具体地，所述枯草芽孢杆菌N65的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：
[0009]上述的肠源枯草芽孢杆菌株的应用，所述肠源枯草芽孢杆菌株用于制备抑制致病菌的微生物态制剂。
[0010]本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：
[0011]上述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，包括以下步骤：
[0012]1)样品采集：称取健康成年猪的肠道内容物，清洗灭菌后，在加热条件下孵育，加入溶剂稀释，得到不同稀释倍数的处理原液；
[0013]2)菌株的分离：将不同稀释倍数的处理原液分别涂布于胆盐耐受培养基上，进行培养至有明显的单菌落长出，选择单个、具备明显芽孢杆菌菌落特征的优势类型，在分离培养基上重新划线，进行培养，再选择不同菌落的分离株进行进一步筛选；
[0014]3)抑菌对峙初筛：以金黄色葡萄球菌为指示菌，首先通过斜面培养，制备指示菌悬液，再制备含有指示菌悬液的对峙平板，最后将划线分离的单菌落分别点植于对峙平板，进行对峙培养，然后选取有明显抑菌圈的菌株，并记录抑菌圈直径(B)与菌落直径(C)的比值；
[0015]4)产酶特性复筛：将对指示菌具备明显抑菌圈的菌株分别点植于不同的产酶筛选培养基进行培养，再分别加入刚果红或碘溶液，以测定纤维素酶、木聚糖酶或淀粉酶活性，蛋白酶平板无需染色即可观察，记录菌株透明圈直径(H)和菌落直径(C)的比值，得到具有抑菌和产酶特性的菌株；
[0016]5)菌株的分子鉴定：采用菌落PCR的方法扩增分离步骤4)获得的菌株的16S rDNA基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测并回收目标产物，并进行测序，测序结果与GenBank中的16S rRNA序列进行BLAST及系统发育分析；
[0017]6)菌株代谢产物生物学特性测试：对步骤4)所得的菌株进行菌株斜面活化，制备斜面菌株悬液，然后对菌悬液进行摇瓶发酵培养，培养结束后，离心收集发酵上清液，并将上清液进行除菌，收集无菌发酵上清液；使用上清液生物学特性测试，其中，生物学特性测试为温度耐受性检测、胆盐耐受性检测、人工胃肠液的稳定性、pH稳定性检测和溶血活性检测中的一种或两种以上组合测试；
[0018]7)菌株的分离和筛选：选取步骤6)中生物学特性测试中性能最优的菌株，筛选得到抑菌和产酶能力最好的枯草芽孢杆菌N65，并对枯草芽孢杆菌N65进行分子鉴定和基因测序的考察，最终获得肠源枯草芽孢杆菌株N65并进行保藏。
[0019]进一步，步骤1)中，健康成年猪十二指肠、空肠、回肠各部分5～6cm，剪断后两端分别用灭菌棉绳扎紧，并立即存放于冰盒中，并在无菌环境中将各肠段内容物挤出混合，称取4～6g的肠道内容物，加入带有灭菌玻璃珠、并且含有50mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)的三角瓶中，80℃水浴孵育10min，取1mL上清液用无菌的PBS进行10倍梯度稀释至10
‑3、10
‑4与10
‑5三个浓度，得到不同稀释倍数的处理原液。
[0020]再进一步，步骤2)中，将步骤1)中稀释至10
‑3、10
‑4与10
‑5三个浓度的处理原液分别涂布于胆盐耐受培养基上，37℃倒置培养48h，至有明显的单菌落长出。选择单个、具备明显芽孢杆菌菌落特征的优势类型，在分离培养基上重新划线，37℃培养24h，再选择不同菌落的分离株进行进一步筛选。
[0021]进一步，步骤3)中，以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过斜面培养制备指示菌的浓度为(1～2)
×
109CFU/mL的指示菌悬液，然后按照每100mL检菌培养基0.5mL的指示菌悬液比例，制备含有指示菌悬液的对峙平板，最后将划线分离的单菌落分别点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠源枯草芽孢杆菌株，其特征在于，所述肠源枯草芽孢杆菌株命名为枯草芽孢杆菌N65，保藏号为GDMCC No:62369，保藏日期为2022年4月11日，保藏分类命名为枯草芽孢杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。2.如权利要求1所述的肠源枯草芽孢杆菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌N65的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。3.权利要求1或2所述的肠源枯草芽孢杆菌株的应用，其特征在于，所述肠源枯草芽孢杆菌株用于制备抑制致病菌的微生物态制剂。4.权利要求1或2所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)样品采集：称取健康成年猪的肠道内容物，清洗灭菌后，在加热条件下孵育，加入溶剂稀释，得到不同稀释倍数的处理原液；2)菌株的分离：将不同稀释倍数的处理原液分别涂布于胆盐耐受培养基上，进行培养至有明显的单菌落长出，选择单个、具备明显芽孢杆菌菌落特征的优势类型，在分离培养基上重新划线，进行培养，再选择不同菌落的分离株进行进一步筛选；3)抑菌对峙初筛：以金黄色葡萄球菌为指示菌，首先通过斜面培养，制备指示菌悬液，再制备含有指示菌悬液的对峙平板，最后将划线分离的单菌落分别点植于对峙平板，进行对峙培养，然后选取有明显抑菌圈的菌株，并记录抑菌圈直径(B)与菌落直径(C)的比值；4)产酶特性复筛：将对指示菌具备明显抑菌圈的菌株分别点植于不同的产酶筛选培养基进行培养，再分别加入刚果红或碘溶液，以测定纤维素酶、木聚糖酶或淀粉酶活性，蛋白酶平板无需染色即可观察，记录菌株透明圈直径(H)和菌落直径(C)的比值，得到具有抑菌和产酶特性的菌株；5)菌株的分子鉴定：采用菌落PCR的方法扩增分离步骤4)获得的菌株的16S rDNA基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测并回收目标产物，并进行测序，测序结果与GenBank中的16S rRNA序列进行BLAST及系统发育分析；6)菌株代谢产物生物学特性测试：对步骤4)所得的菌株进行菌株斜面活化，制备斜面菌株悬液，然后对菌悬液进行摇瓶发酵培养，培养结束后，离心收集发酵上清液，并将上清液进行除菌，收集无菌发酵上清液；使用上清液生物学特性测试，其中，生物学特性测试为温度耐受性检测、胆盐耐受性检测、人工胃肠液的稳定性、pH稳定性检测和溶血活性检测中的一种或两种以上组合测试；7)菌株的分离和筛选：选取步骤6)中生物学特性测试中性能最优的菌株，筛选得到抑菌和产酶能力最好的枯草芽孢杆菌N65，并对枯草芽孢杆菌N65进行分子鉴定和基因测序的考察，最终获得肠源枯草芽孢杆菌株N65并进行保藏。5.如权利要求4所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，步骤1)中，健康成年猪十二指肠、空肠、回肠各部分5～6cm，剪断后两端分别用灭菌棉绳扎紧，并立即存放于冰盒中，并在无菌环境中将各肠段内容物挤出混合，称取4～6g的肠道内容物，加入带有灭菌玻璃珠、并且含有50mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)的三角瓶中，80℃水浴孵育10min，取1mL上清液用无菌的PBS进行10倍梯度稀释至10
‑3、10
‑4与10
‑5三个浓度，得到不同稀释倍数的处理原液。6.如权利要求4所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，步骤2)中，将步
骤1)中稀释至10
‑3、10
‑4与10
‑5三个浓度的处理原液分别涂布于胆盐耐受培养基上，37℃倒置培养48h，至有明显的单菌落长出。选择单个、具备明显芽孢杆菌菌落特征的优势类型，在分离培养基上重新划线，37℃培养24h，再选择不同菌落的分离株进行进一步筛选。7.如权利要求4所述的肠源枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征在于，步骤3)中，以金黄色葡萄球菌为指示菌，通过斜面培养制备指示菌的浓度为(1～2)
×
109CFU/mL的指示菌悬液，然后按照每100mL检菌培养基0.5mL的指示菌悬液比例，制备含有指示菌悬液的对峙平板，最后将划线分离的单菌落分别点植于对峙平板，37℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：林万华，黄钦耿，王珍珍，张文，赵燕玉，蔡玉凤，陈健，
申请(专利权)人：清远一生自然生物研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：