全血中四种免疫抑制剂的检测方法技术

本发明专利技术涉及治疗药物监测技术领域，具体涉及全血中四种免疫抑制剂的检测方法。本发明专利技术提供一种准确测定全血中四种免疫抑制剂药物浓度的检测方法，本方法操作简单，仅有简单的加样、移样、混匀、磁分离等操作过程，无需进行复杂的净化提纯步骤就可以获得干净的处理液，一次样本处理同时完成四种免疫抑制剂药物提取，处理液可直接用于液相色谱串联质谱检测，实现一次进样同时检测四种免疫抑制剂药物浓度，提高了检测通量；同时本方法具有较好的除磷脂、除蛋白效果，可降低本底，提高检测的灵敏度。提高检测的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
全血中四种免疫抑制剂的检测方法


[0001]本专利技术涉及治疗药物监测
，具体涉及全血中四种免疫抑制剂的检测方法。

技术介绍

[0002]免疫抑制剂是一类抑制与免疫反应相关细胞(主要是T细胞和B细胞)增殖和功能的药物，能降低免疫应答，使免疫应答在合适的强度和时间内，从而防治疾病，维持机体内环境稳定。排异是实体器官移植术后最主要的障碍之一。免疫抑制剂在器官移植抗排斥反应方面具有极重要的作用，除此之外，宿主抗移植物病、超敏反应引起的疾病以及类风湿性关节炎、风湿热、红斑狼疮等自身免疫性疾病也主要运用免疫抑制剂治疗。
[0003]他克莫司、环孢霉素A、西罗莫司、依维莫司是目前临床最常用的四种免疫抑制剂药物，其治疗窗窄、药物动力学个体差异大，必须进行治疗药物监测。临床常用不同组合的免疫抑制剂治疗用药方案，因此，一次进样同时检测四种免疫抑制剂药物浓度，极大的帮助临床医生获得更为完整的治疗用药信息，及时地指导临床医生调整个体化用药方案。
[0004]全血中免疫抑制剂药物浓度测定方法主要有免疫测定法、色谱法(高效液相色谱法)和质谱法(液相色谱串联质谱法)三类技术。
[0005]免疫测定法是基于抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。缺点是通常要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清非常困难且工作量大，测定步骤多，操作繁琐。除此之外，免疫磁珠特异性不高，药物与抗体的非特异性结合常导致免疫测定浓度过大或异常，且每次仅能够测定一种药物，然而针对不同人群的联合用药，因为要监测多个药物浓度，免疫测定法测定成本及效率大打折扣。
[0006]色谱法是利用样品中各组分与流动相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交换等性能上的差异)，先将它们分离，后按一定顺序检测各组分及其含量的方法，本质上是一种分离分析方法。缺点是被分离组分的定性较为困难，分析时间长，所需样本量大。另外，比如液相色谱
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紫外光谱法(HPLC
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UV)虽然可以测定环孢霉素A、西罗莫司，但对一些血药浓度较低或没有生色基团的药物如他克莫司则难以测定。除此之外，色谱法采用外标法定量，不使用校正因子，虽然准确性也比较高，但是操作条件变化对结果准确性影响较大，对进样量的准确性控制要求较高。
[0007]质谱法结合了液相色谱的高分离能力和质谱的高选择性及高灵敏度，二者结合以后可以不再刻意纠结于色谱分离条件，因为质谱信息差异就可以区分很多不同物质。质谱法如液相色谱串联质谱法是通过分析离子化样品的质荷比来实现对被测化合物定性定量分析。样本处理通常涉及简单的蛋白质沉淀，全血样本中加入内标溶液、硫酸锌溶液、甲醇、乙腈中的几种试剂相互搭配，涡旋混合，离心得到上清液，上清液进入质谱分析。如专利CN2018112470947公开的准确测定人全血中四种免疫抑制剂类药物浓度的试剂盒及检测方法，样本处理方式即为典型的简单蛋白沉淀，此方法虽然简单、快速和方便，但是需要借助
离心机离心沉淀蛋白，难以实现自动化，此外，通量受到离心机转子影响，会出现效率低、人为误差等问题，不易实现自动化、大批量操作。专利CN2018112488118公开的用于准确测定人全血中四种免疫抑制剂类药物浓度的试剂盒及检测方法，简单蛋白沉淀后增加了液液萃取，此方法虽然能进一步净化样本，但操作本身繁琐，耗时长，不易实现自动化操作。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供全血中四种免疫抑制剂的检测方法。
[0009]本专利技术提供了全血中免疫抑制剂的检测方法，其包括对待测全血样品进行前处理后，采用液相色谱串联质谱检测；
[0010]本专利技术中，所述待测全血样品前处理包括将待测样品与内标溶液混匀后依次加入红细胞裂解液、蛋白沉淀剂和磁珠溶液，磁分离后取上清进行液相色谱串联质谱检测定量分析；
[0011]进一步的，所述内标为待测物的同位素或者结构类似物，其根据待测目标物的变化而发生改变。本专利技术的一些具体实施例中，所述内标溶液包括:环孢霉素A
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d
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、西罗莫司
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d3、依维莫司
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d4和子囊霉素。更进一步的，在一些具体的实施例中，本专利技术所述的内标溶液为1000ng/ml环孢霉素A
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d12、100ng/ml西罗莫司
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d3、100ng/ml依维莫司
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d4和100ng/ml子囊霉素。
[0012]本专利技术中，所述红细胞裂解液为硫酸锌溶液；所述硫酸锌溶液的溶剂为水，其中，硫酸锌的浓度为0.1～0.3mol/L；
[0013]所述蛋白沉淀剂为甲醇乙腈溶液，其中，甲醇的体积分数为30％；
[0014]所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～10mg/mL。
[0015]进一步的，本专利技术中，所述磁珠溶液中的磁珠类型为羧基官能团磁珠；所述的羟基官能团包括1
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18烷基、辛基、苯基、环己基等类型官能团。
[0016]更进一步的，本专利技术所述待测全血样品、内标溶液、红细胞裂解液、蛋白沉淀剂与磁珠溶液的添加体积比为10：1：20：30：10。
[0017]本专利技术所述的检测方法中，所述免疫抑制剂包括环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司和依维莫司；
[0018]其中，所述液相色谱串联质谱的色谱条件包括：
[0019]流动相A：由去离子水、乙酸铵和甲酸组成，其中，甲酸的体积分数为0.1％，乙酸铵的浓度为2mM；
[0020]流动相B：由甲醇、乙酸铵和甲酸组成，其中，甲酸的体积分数为0.1％，乙酸铵的浓度为2mM；
[0021]洗脱程序为：
[0022]第0～0.2min，流动相B的体积分数为50％；
[0023]第0.2～1.0min，流动相B的体积分数由50％至100％；
[0024]第1.0～2.0min，流动相B的体积分数为100％；
[0025]第2.0～2.1min，流动相B的体积分数由100％至50％；
[0026]第2.1～3.0min，流动相B的体积分数为50％。
[0027]进一步的，所述液相色谱串联质谱的色谱条件为：分析柱为C18或苯基柱；流速：0.5ml/min；柱温：50℃；进样室温度：2～8℃；进样体积：10μl。所述液相色谱串联质谱的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描；所述正离子MRM扫描具体参数为：离子化电压5500(V)、温度550℃、气帘气35psi、碰撞气7psi、喷雾气50psi、辅助加热气50psi。
[0028]在一些具体的实施例中，本专利技术采用C18柱进行所述的液相色谱分析。
[0029]本专利技术中，所述的液相色谱串联质谱条件用于四种免疫抑制剂的检测，其检测结果准确，能实现检测物质的定量及定性分析；液相色谱串联质谱条件结合特定步骤参本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.全血中免疫抑制剂的检测方法，其包括对待测全血样品进行前处理，然后采用液相色谱串联质谱检测；待测全血样品前处理包括：将待测样品与内标溶液混匀后依次加入红细胞裂解液、蛋白沉淀剂和磁珠溶液，磁分离后取上清；所述内标溶液包括环孢霉素A
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、西罗莫司
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d3、依维莫司
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d4和子囊霉素；所述红细胞裂解液为硫酸锌溶液；所述硫酸锌溶液的溶剂为水，其中，硫酸锌的浓度为0.1～0.3mol/L；所述蛋白沉淀剂为甲醇乙腈溶液，其中，甲醇的体积分数为30％；所述磁珠溶液由水、甲醇和磁珠组成，其中，甲醇的体积分数为1％～20％，磁珠的浓度为0.5～10mg/mL。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磁珠溶液中的磁珠类型为羧基官能团磁珠；所述内标溶液为1000ng/ml环孢霉素A
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d
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、100ng/ml西罗莫司
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d3、100ng/ml依维莫司
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d4和100ng/ml子囊霉素。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测全血样品、内标溶液、红细胞裂解液、蛋白沉淀剂与磁珠溶液的添加体积比为10：1：20：30：10。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述免疫抑制剂包括环孢霉素A、他克莫司、西罗莫司和依维莫司；所述液相色谱串联质谱的色谱条件包括：流动相A：由去离子水、乙酸铵和甲酸组成，其中，甲酸的体积分数为0.1％，乙酸铵的浓度为2mM；流动相B：由甲醇、乙酸铵和甲酸组成，其中，甲酸的体积分数为0.1％，乙酸铵的浓度为2mM；洗脱程序为：第0～0.2min，流动相B的体积分数为50％；第0.2～1.0min，流动相B的体积分数由50％至100％；第1.0～2.0min，流动相B的体积分数为100％；第2.0～2.1min，流动相B的体积分数由100％至50％；第2.1～3.0min，流动相B的体积分数为50％。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的色谱条件为：分析柱为C18柱；流速：0.5ml/min；柱温：50℃；进样室温度：2～8℃；进样体积：10μL。6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM扫描...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宾宾，蔡克亚，刘亚娟，高培丽，申业明，孙江彦，杨雪莹，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：