一种β-HCG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
HCG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法


[0001]本申请属于分子检测领域，具体涉及一种β
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HCG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，以及一种β
‑
HCG化学发光免疫检测方法。

技术介绍

[0002]与黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)和促甲状腺激素(TSH)相似，人体绒毛膜促性腺激素(HCG)是糖蛋白家族成员之一，由2个亚基(α
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和β
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链)连接组成完整的激素。上述4种糖蛋白激素的α
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链结构相同，β
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链结构不同，并与激素的特定功能有关。怀孕时HCG由胎盘产生。对于非
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妊娠妇女，滋养层细胞瘤、含滋养层组织的生殖细胞瘤以及一些非
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滋养层细胞瘤也可产生HCG。
[0003]人绒毛膜促性腺激素包括多种分子量大小不一同工激素。HCG的生物作用是维持妊娠黄体。同时也影响类固醇的生成。妊娠妇女血清中主要含有整分子的HCG。检测结果的异常偏高则提示绒毛膜癌、葡萄胎或多胎妊娠可能。检测结果偏低则提示先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒或胎儿宫内死亡。
[0004]目前，HCG的免疫检测方法有多种，其中包括放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析法(GICA)、荧光免疫层析法(FICA)及近年来逐渐被广泛使用的化学发光法(CLIA)等。
[0005]放射性同位素免疫分析法(RIA)是利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。放射性同位素免疫分析法有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果等问题。
[0006]酶联免疫吸附法(ELISA)检测原理，以双抗体夹心法为例，是在固相载体上包被一种特异性抗体，加入待测样本后，再加入酶标记的另一种抗体，形成双抗体夹心复合物，再通过发光底物的显色作用，使仪器可以定量检测出的免疫反应。酶联免疫吸附法操作繁琐时间长、灵敏度低、线性范围窄、自动化程度低。
[0007]胶体金免疫层析法(GICA)作为POCT检验的一种方法，具有样本量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。其原理如下，仍以双抗体夹心法为例，当含有抗原的样本滴加到吸收孔后，抗原先与胶体金标记的抗体结合形成抗原
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抗体复合物，然后固定在样品垫上的另一种抗原会捕获该复合物，形成双抗体夹心复合物，并产生一个色带，而被检测到的免疫检测法。胶体金免疫层析法存在灵敏度差、线性范围窄、定量准确度差等问题。
[0008]荧光免疫层析法(FICA)相比于传统的免疫层析法区别在于以荧光微球代替胶体金作为抗体载体，既保留了传统胶体金层析试纸条的现场快速检测优点，又加入了荧光检测技术的高灵敏度特点，提高免疫层析方法检测性能。荧光免疫层析法存在自动化程度低、检测通量较小的缺点。
[0009]化学发光法作为近年来逐渐兴起的一种免疫检测技术，是将免疫反应系统和化学
发光技术紧密结合的产物。其中化学发光技术是利用发光物质，如吖啶酯等，经氧化剂氧化和催化剂催化后，形成一个激发态的中间体，再利用相应的测量仪器测量该中间体在回到基态时产生的光量子产额的检测手段。而免疫反应系统是将发光标记物质标记在抗原或抗体上，再通过形成抗原
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抗体复合物进行检测。相比于上述其他方式，该技术具有特异性强、灵敏度高、精密度好、线性范围宽、高通量和易于实现自动化的优点。化学发光法按发光原理可分为酶促化学发光和直接化学发光。
[0010]酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶两种，但都有一定的局限性。辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。碱性磷酸酶主要缺点为：底物达到平台期的时间长，底物成本高，导致检测成本高，患者负担重。专利CN102998467B公开了一种三试剂的β人绒毛膜促性腺激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及方法，发光底物为辣根过氧化物酶，反应时间长，检测线性范围仅到1000mIU/ml，分析灵敏度不高于2mIU/mL。
[0011]直接化学发光相比酶促化学发光具有明显优势，主要表现在：反应迅速，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，可以两点定标，体系简单，底物液成本低，光子产率较高。专利CN107561293A公开了一种化学发光免疫检测试剂盒，其包括抗人绒毛膜促性腺激素抗体重组蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白标记的化学发光标记物。但该试剂盒使用样本量多(50微升)，检测线性范围仅到1000mIU/ml，灵敏度为1mIU/ml。
[0012]上述检测方法的检测线性范围、灵敏度等检测性能还有待进一步提高。

技术实现思路

[0013]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有的β
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HCG检测方法的检测线性范围和灵敏度等检测性能不佳的缺陷，而提供一种检测线性范围和灵敏度有显著提升、且兼具优异的特异性、抗干扰能力和精密度等检测性能的β
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HCG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，及一种β
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HCG化学发光免疫检测方法。
[0014]本专利技术检测β
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HCG的方法是双抗体夹心法。该法使用两株不同的抗β
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HCG单克隆抗体，其中一株被标记于示踪标记物，另一株包被于磁珠上。当样本中存在β
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HCG抗原时，示踪标记物标记的抗体、包被磁珠的抗体、以及β
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HCG抗原形成抗体
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抗原
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抗体夹心复合物，通过该复合物中的示踪标记物发光，仪器采集发光信号值。样本中β
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HCG抗原的浓度和信号值成正比，通过标准曲线，即可测定样本中β
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HCG的含量。本专利技术在现有多达几十种的抗β
‑
HCG抗体中，特别选择了两株配对用于双抗体夹心法，意外发现可获得显著优异的线性范围、灵敏度等检测性能，远优于现有检测方法。
[0015]本专利技术通过下述技术方案解决上述技术问题：
[0016]本专利技术提供一种β
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HCG化学发光免疫检测试剂盒，其包括：包被抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
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5009的磁珠和示踪标记物标记的抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5006。
[0017]本专利技术中，所述抗β
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HCG抗体Anti
‑
HCG
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5009和抗β
‑
HCG抗体Anti...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
‑
HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于其包括：包被抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5009的磁珠和示踪标记物标记的抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5006。2.如权利要求1所述的β
‑
HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的磁珠的表面带有
‑
NH2或
‑
COOH，和/或，所述的磁珠的粒径为1
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5μm，更佳地为1.5μm。3.如权利要求1所述的β
‑
HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠与所述抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5009的质量比为100:1.5
‑
0.5，较佳地为100:1.5
‑
1，和/或，所述的包被抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5009的磁珠以悬浮液的形式存在；所述的包被抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5009的磁珠的浓度按磁珠浓度计，为0.1
‑
1mg/mL。4.如权利要求1所述的β
‑
HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的示踪标记物为吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或金刚烷；和/或所述示踪标记物与所述抗β
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HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5006的质量比为1:5
‑
20，较佳地为1:10；和/或所述的示踪标记物标记的抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5006以溶液的形式存在；所述示踪标记物标记的抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5006的浓度按抗体浓度计，为0.1
‑
1.5μg/mL。5.如权利要求1所述的β
‑
HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
‑
5009的磁珠和所述示踪标记物标记的抗β
‑
HCG抗体Anti
‑
HCG
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5006存于稀释液；所述的稀释液为含封闭蛋白的缓冲液；所述封闭蛋白较佳地为牛血清白蛋白和/或酪蛋白；所述封闭蛋白的浓度较佳地为0.1
‑
5wt％，更佳地为1％
‑
5wt％，最佳地为3wt％；所述缓冲液较佳地为PBS缓冲液或MES缓冲液；所述缓冲液的pH可为7
‑
9，较佳地为7
‑
8，更佳地为7.4；所述PBS缓冲液的摩尔浓度可为10
‑
100mM，较佳地为50mM；所述的稀释液还可含有无机盐类、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种；所述无机盐优选氯化钠；所述无机盐的含量较佳地为0.5
‑
1.5wt％，更佳地为0.9wt％；所述表面活性剂较佳地为Triton X
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100、Triton X
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405、吐温
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20和吐温
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80中的一种或多种；所述表面活性剂的量较佳地为0.01
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2wt％，更佳地为0.01％
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0.1wt％，最佳地为0.05wt％；所述防腐剂较佳地为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、Proclin
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300和抗生素中的一种或多种；防腐剂的含量较佳地为0.01
‑
0.03wt％；所述稀释液较佳地为含氯化钠、牛血清白蛋白、吐温
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20、Proclin
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300和庆大霉素溶液的pH 7
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8的缓冲液，更佳地为含0.5
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1.5wt％氯化钠、1
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5wt％牛血清白蛋白、0.01
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0.1wt％吐温
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20、0.01wt％ProclinTM300和0.01wt％庆大霉素的pH 7
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8的10
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100mM PBS缓冲液。6.如权利要求1所述的β
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HCG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的包被抗β
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HCG抗体Anti
‑
HCG
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5009的磁珠按包括下述步骤的方法制得：将表面官能团活化后的磁珠与抗β
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HCG抗体Anti
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HCG
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5009混合，孵育，即得；所述表面官能团活化后的磁珠较佳地按下述方法制得：将磁珠与1
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【专利技术属性】
技术研发人员：朱传增，石晓强，徐建新，李福刚，
申请(专利权)人：上海奥普生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：