【技术实现步骤摘要】
一种验证并检测胞内RBP与靶RNA互作的方法
[0001]本专利技术属于分子生物学与生物化学领域，具体涉及一种验证并检测胞内RNA结合蛋白（RBP）与靶RNA互作的方法。
技术介绍
[0002]RNA结合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）在转录后水平上调节基因表达起着重要作用，包括pre
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mRNA剪接、聚腺苷化、维持mRNA稳定、介导mRNA从细胞核向细胞质运输、mRNA定位以及翻译调控等。RBPs功能的实现主要通过与目标RNA分子中的特定序列元件结合来实现的。虽然目前许多已知RBPs识别的RNA核苷酸序列是明确的，但新发现的RBP或者人工合成的RBP与靶RNA分子的互作需要检测和鉴定。科学家已经开发了多种方法来检测、验证RBPs与靶RNA核苷酸序列的互作，如电泳迁移率迁移试验(EMSA)、指数富集的配体系统进化技术 (SELEX)、RNA pull
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down实验、RNA足迹法、RNA免疫共沉淀 (RIP)、紫外线诱导的交联免疫共沉淀偶联高通量测序、酵母三杂交、...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种验证并检测胞内RBP与靶RNA互作的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）以 His9
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PK 质粒为模板，酶切时载体为 pETDuet
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1空载体，构建pETDuet
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PK表达载体；（2）以His9
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RFP质粒为模板，所述pETDuet
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PK表达载体作为酶切时载体，构建pETDuet
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PKRFP表达载体；同时以pUC57
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ERBS1质粒为模板，构建pETDuet
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ERBS1表达载体；进一步，以pETDuet
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PKRFP质粒为模板，以pETDuet
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ERBS1表达载体为酶切时载体，构建pETDuet
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ERBS1
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PKRFP表达载体；（3）分别接种步骤（2）构建的pETDuet
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PKRFP和pETDuet
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ERBS1
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PKRFP载体，诱导其表达蛋白并分离纯化，得到目的蛋白；（4）对所述各目的蛋白进行SDS
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PAGE结果检测；（5）检测含有所述各表达载体细胞的RFP荧光信号并记录；（6）利用荧光显微镜检测含有所述各表达载体细胞中RFP基因的表达情况；（7）根据步骤（5）和步骤（6）的实验结果分析验证胞内RBP与靶RNA互作情况。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）具体过程为：以His9
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PK质粒为模板进行PCR扩增，采用的引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，获得目标PCR产物后进行酶切、割胶回收并与pETDuet
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1载体连接，连接产物转化到DH5α菌株，进一步经抗性筛选、测序验证获得pETDuet
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PK表达载体。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中pETDuet
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PKRFP表达载体构建过程为：以His9
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RFP质粒为模板进行第一次 PCR 扩增，采用的引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；将所得PCR 产物作为模板进行第二次 PCR 扩增，采用的引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4所示；以所述第二次 PCR 扩增产物作为目的基因，进行酶切、割胶回收并与pETDuet
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PK载体连接，连接产物转化至DH5α菌株，进一步经抗性筛选、测序验证获得pETDuet
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PKRFP表达载体；产生的PKRFP核酸序列从PK基因的AUG编码，其终止子UGA位于1582
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1584处，后续的RFP基因不能得到翻译；PKRFP序列的1505处具有核糖体的识别位点（AGGAGA），其下游的密码子AUG起始蛋白质翻译，可翻译完整的RFP蛋白质。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中pETDuet
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ERBS1 表达载体构建过程为：以pUC57
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ERBS1质粒为模板进行 PCR 扩增，采用的引物对的序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；以所述PCR 扩增产物为目的基因，进行酶切、割胶回收并与pETDuet
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【专利技术属性】
技术研发人员：高璐，孙梅好，李欣，王慧慧，吴智华，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：
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