促进番茄果实成熟的基因及其调控方法技术

促进番茄果实成熟的基因及其调控方法，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。本发明专利技术通过从番茄中得到SlIMP3基因完整的编码序列，设计靶点，将靶点连接到载体CRIPSR/Cas9上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得基因编辑植株，对基因编辑植株进行了分析，结果表明该基因编辑后能够加速番茄果实成熟。后能够加速番茄果实成熟。后能够加速番茄果实成熟。

【技术实现步骤摘要】
促进番茄果实成熟的基因及其调控方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法，特别涉及一种编码番茄核输入蛋白的基因SlIMP3，该基因在促进番茄果实成熟中的应用。

技术介绍

[0002]番茄果实富含丰富的维生素C、番茄红素以及少量人体所需的磷、钾等多种营养物质，且具有口味酸甜、易于加工、能通过种子繁殖或通过顶端和嫩枝扦插无性繁殖等优点，番茄作为一种受欢迎的果蔬作物，每年向果蔬市场供应的番茄数量占据较大比重，但其果实生长周期较长，因此，促进番茄早熟，对于缩短果实培育周期，抵御植物种植和销售风险具有重要意义，同时也能使番茄果实提早上市，提高市场销售价格，增加生产效益，番茄遗传背景清晰，是一种可用于果实发育研究的模式植物，因其突变体材料易于获得且可用于生产研究，使得番茄成为基因编辑材料的理想植物，Crispr/Cas9介导的基因编辑技术已在番茄中得到应用，因此，番茄被广泛用于基因功能的研究，尤其是与果实发育相关的基因功能，包括果实发育和成熟的机制研究，果实成熟的研究对于揭示果实发育的机制至关重要，有助于提高产量、品质优化，近些年研究发现，H2S作为植物体内的一种气体信号分子，可以参与植物体内多种生理过程，并能延缓多种果蔬的成熟衰老进程，研究表明，半胱氨酸脱巯基酶LCD1是介导番茄内源H2S生成的关键酶，LCD1缺失加速番茄果实成熟衰老进程，实验室前期研究发现LCD1定位于细胞核，利用酵母双杂交实验和荧光素酶互补实验发现LCD1与核输入蛋白importin α3之间存在相互作用，核输入蛋白importin α3是参与介导LCD1进入细胞核的关键蛋白，importin α3是否通过介导LCD1细胞核定位，进而调控番茄果实成熟尚不清楚，番茄果实在成熟衰老进程中会发生多种物质的代谢，色素代谢是此阶段中最显著的特征，果实色素沉积的变化是由于叶绿素降解，而类胡萝卜素在细胞中大量积累所致，番茄果实成熟进程主要分为三个阶段：绿熟期、破色期和红熟期，番茄果实中与叶绿素降解途径相关酶的编码基因有：叶绿素b还原酶（chlorophyll b reductase，NYC1）、脱镁叶绿酸a水解酶（pheophytinase，PPH）、脱镁叶绿酸a加氧酶（pheophorbide a oxygenase，PAO）和滞绿蛋白（stay
‑
green protein，SGR1），已有研究将番茄中类胡萝卜素代谢途径的三个关键基因成功鉴定出来，分别是编码八氢番茄红素酶的基因PSY、编码八氢番茄红素脱氢酶的基因PDS和编码胡萝卜素脱氢酶的基因ZDS，其中PSY调控番茄果实类胡萝卜素的合成，PDS和ZDS是其代谢通路的下游关键基因。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种促进番茄果实成熟的基因及其调控方法，为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的基因，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。
[0004]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的调控方法，包括下列步骤：步骤1：将10 μL靶点一正向引物
‑
F1、10 μL靶点一反向引物
‑
R1、80 μL ddH2O混匀；再将10 μL靶点二正向引物
‑
F2、10 μL靶点二反向引物
‑
R2、80 μL ddH2O混匀；将以上两管引物混合物分别置于PCR仪中，88
‑
92℃条件下处理25
‑
35s，然后移至室温冷却，完成靶点引物退火，分别作为靶点一接头和靶点二接头；靶点一正向引物
‑
F1：5
’‑
GTCAGAGGCCAAGTGATAGGACCG
‑3’
；靶点一反向引物
‑
R1：5
’‑
AAACCGGTCCTATCACTTGGCCTC
‑3’
；靶点二正向引物
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F2：5
’‑
GTCAGCGGCCTTCGTCGGCATCAA
‑3’
；靶点二反向引物
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R2：5
’‑
AAACTTGATGCCGACGAAGGCCGC
‑3’
；步骤2：配制10μL酶切连接反应液，利用边切边连法，使靶点一接头和靶点二接头分别与gRNA表达盒连接，包括：0.5μL靶点一接头，1 μL gRNA质粒U3d/U3b，1μL 10
×
cutsmart buffer，0.4 μL BsaI，0.1 μL T4 DNA ligase，0.4 μL T4 DNA ligase buffer，ddH2O补足至10 μL；PCR扩增参数为：37℃ 5min，20℃ 5min，5个循环，4℃ ∞；得到靶点一产物；0.5μL靶点二接头，1 μL gRNA质粒U3d/U3b，1μL 10
×
cutsmart buffer，0.4 μL BsaI，0.1 μL T4 DNA ligase，0.4 μL T4 DNA ligase buffer，ddH2O补足至10 μL；PCR扩增参数为：37℃ 5min，20℃ 5min，5个循环，4℃ ∞；得到靶点二产物；步骤3：第一轮PCR扩增：分别以步骤2得到的靶点一产物和靶点二产物为模板，进行PCR扩增，包括：靶点一反应1体系：1 μL靶点一产物，2 μL靶点一反向引物
‑
R1，2 μL引物U
‑
F，1 μL dNTPs，10 μL 5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer，1 μL Super
‑
Fidelity DNA Polymerase，33 μL ddH2O；PCR条件：95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 15 s ，72℃ 15 s，25个循环；72℃ 10 min；4℃ ∞，得到第一产物；引物U
‑
F：5
’‑
CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
‑3’
；靶点二反应1体系：1 μL靶点二产物，2 μL靶点二反向引物
‑
R2，2 μL引物U
‑
F，1 μL dNTPs，10 μL 5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer，1 μL Super
‑
Fidelity DNA Polymerase，33 μL ddH2O；PCR条件：95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 15 s ，72℃ 15 s，25个循环；72℃ 10 min；4℃ ∞，得到第二产物；引物U
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F：5
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CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
‑3’
；靶点一反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进番茄果实成熟的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。2.一种促进番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：将10 μL靶点一正向引物
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F1、10 μL靶点一反向引物
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R1、80 μL ddH2O混匀；再将10 μL靶点二正向引物
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F2、10 μL靶点二反向引物
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R2、80 μL ddH2O混匀；将以上两管引物混合物分别置于PCR仪中，88
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92℃条件下处理25
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35s，然后移至室温冷却，完成靶点引物退火，分别作为靶点一接头和靶点二接头；靶点一正向引物
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F1：5
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GTCAGAGGCCAAGTGATAGGACCG
‑3’
；靶点一反向引物
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R1：5
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；靶点二正向引物
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F2：5
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GTCAGCGGCCTTCGTCGGCATCAA
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；靶点二反向引物
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R2：5
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AAACTTGATGCCGACGAAGGCCGC
‑3’
；步骤2：配制10μL酶切连接反应液，利用边切边连法，使靶点一接头和靶点二接头分别与gRNA表达盒连接，包括：0.5μL靶点一接头，1 μL gRNA质粒U3d/U3b，1μL 10
×
cutsmart buffer，0.4 μL BsaI，0.1 μL T4 DNA ligase，0.4 μL T4 DNA ligase buffer，ddH2O补足至10 μL；PCR扩增参数为：37℃ 5min，20℃ 5min，5个循环，4℃ ∞；得到靶点一产物；0.5μL靶点二接头，1 μL gRNA质粒U3d/U3b，1μL 10
×
cutsmart buffer，0.4 μL BsaI，0.1 μL T4 DNA ligase，0.4 μL T4 DNA ligase buffer，ddH2O补足至10 μL；PCR扩增参数为：37℃ 5min，20℃ 5min，5个循环，4℃ ∞；得到靶点二产物；步骤3：第一轮PCR扩增：分别以步骤2得到的靶点一产物和靶点二产物为模板，进行PCR扩增，包括：靶点一反应1体系：1 μL靶点一产物，2 μL靶点一反向引物
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R1，2 μL引物U
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F，1 μL dNTPs，10 μL 5
×
Super
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Fidelity DNA Polymerase buffer，1 μL Super
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Fidelity DNA Polymerase，33 μL ddH2O；PCR条件：95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 15 s ，72℃ 15 s，25个循环；72℃ 10 min；4℃ ∞，得到第一产物；引物U
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F：5
’‑
CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
‑3’
；靶点二反应1体系：1 μL靶点二产物，2 μL靶点二反向引物
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R2，2 μL引物U
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F，1 μL dNTPs，10 μL 5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer，1 μL Super
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Fidelity DNA Polymerase，33 μL ddH2O；PCR条件：95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 15 s ，72℃ 15 s，25个循环；72℃ 10 min；4℃ ∞，得到第二产物；引物U
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F：5
’‑
CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
‑3’
；靶点一反应2体系：1 μL靶点一产物，2 μL靶点一正向引物
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F1，2 μL引物gRNA
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R，1 μL dNTPs，10 μL 5
×
Super
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Fidelity DNA Polymerase buffer，1 μL Super
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Fidelity DNA Polymerase，33 μL ddH2O；PCR条件：95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 15 s ，72℃ 15 s，25个循环；72℃ 10 min；4℃ ∞，得到第三产物；引物gRNA
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R：5
’‑
CGGAGGAAAATTCCATCCAC
‑3’
；靶点二反应2体系：1 μL靶点二产物，2 μL靶点二正向引物
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F2，2 μL引物gRNA
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R，1 μL dNTPs，10 μL 5
×
Super
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Fidelity DNA Polymerase buffer，1 μL Super
‑
Fidelity DNA Polymerase，33 μL ddH2O，PCR条件：95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 15 s ，72℃ 15 s，25个循环；72℃ 10 min；4℃ ∞，得到第四产物；引物gRNA
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R：5
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CGGAGGAAAATTCCATCCAC
‑3’
；步骤4：第二轮扩增：预先将位置特异引物对混合成10
ꢀ×
工作液，每种1.5 μM：PT1：1.5 μL 引物B1
’ꢀ
+ 1.5 μL 引物B2+7 μL ddH2O；
PT2L：1.5μL引物B2
’
+1.5μL引物BL+7μLddH2O；分别取第一轮PCR扩增的第一产物、第二产物、第三产物和第一产物1μL，用ddH2O稀释10倍，得到第一产物稀释液、第二产物稀释液、第三产物稀释液和第一产物稀释液；第一产物稀释液和第三产物稀释液混合得到第二轮第一模板，第二产物稀释液和第四产物稀释液混合得到第二轮第二模板；2μL第二轮第一模板，3μLPT1，0.6μLdNTPs，6...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡康棣，张华，姚改芳，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：