一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法技术

本发明专利技术公开了一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法，属于基因工程、生物材料制备技术领域。本发明专利技术利用体系中pH 2.8～10.6范围内笼形二十四聚体蛋白的可逆解离和重组，实现对脂溶性或水溶性活性分子(如番茄红素、β

【技术实现步骤摘要】
一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法


[0001]本专利技术涉及一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法，属于基因工程、生物材料制备


技术介绍

[0002]生物纳米技术的发展为改善人类健康和抗击疾病的威胁开辟了新途径，用于预防、诊断和治疗疾病的功能性生物纳米颗粒已被视为纳米材料和生物医药领域的一项重要创新。生物纳米颗粒由于来源于生物体，通常具有良好的物理化学特性、生物相容性、渗透效应和生物安全性，不会激活炎症或免疫反应，其部分活性基团易于进行改性和修饰以实现新功能或增强选择性，例如载药纳米颗粒在人体内的定向药物递送、缓慢释放与靶组织积累，而传统纳米粒子不仅在制备过程中需要大量的有机溶剂，而且很难表现出足够的生物相容性，因此生物纳米颗粒具有明显的开发优势与潜力。
[0003]理想的生物纳米递送载体需能靶向特定的细胞并携带高剂量的起效物质，还应表现出最佳的物化性质和生物相容性。其中，具有可逆自组装特性的天然笼形铁蛋白，作为生物纳米载体已广泛用于包载生物活性营养素或治疗药物。铁蛋白与其他递送载体相比具有明显优势，如粒径均一和组织渗透性、较强的耐热性和稳定性、简单pH值调控下的可逆自组装性、界面易修饰增强功能性、体内受体靶向性等。正是由于人铁蛋白受体在肿瘤细胞上过表达，铁蛋白常被用于包埋抗癌药物提供疾病诊断、治疗及预后方面的信息，比如铁蛋白载阿霉素对肿瘤细胞的靶向治疗以及穿过血脑屏障治疗脑胶质瘤等。由于目前用于营养素开发及药物提送体系研究的主要是重组人源铁蛋白，因此开发海洋生物中的铁蛋白对于丰富铁蛋白资源、寻找活性更好的铁蛋白类型以及探索铁蛋白新功能等方面具有特殊意义。
[0004]牡蛎源铁蛋白在稳定性等方面可能具备比人源铁蛋白更优越的特性，例如pH 2.0～2.8或10.6～11.0范围内可逆解离和重组过程中蛋白变性损失少，而以牡蛎源铁蛋白作为纳米递送载体包埋生物活性分子的方法在国内外还未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法，通过采用体系中一定pH范围内笼形二十四聚体蛋白的可逆解离和重组，实现对脂溶性或水溶性活性分子的包埋，使活性分子的水溶性和稳定性得到显著提升，操作简单且应用性强。
[0006]本专利技术提供了一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法，是将牡蛎铁蛋白在pH＜6或pH＞8的溶液环境中与活性分子混合，再用酸碱调节剂将pH逐渐调节至6.8～7.5之间自组装；所述牡蛎铁蛋白与活性分子的摩尔比为1：(10～1000)。
[0007]在一种实施方式中，所述活性分子包括但不限于番茄红素、β
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胡萝卜素、虾青素或阿霉素。
[0008]在一种实施方式中，所述酸碱调节剂包括但不限于盐酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种。
[0009]在一种实施方式中，所述牡蛎铁蛋白是由重组微生物发酵获得。
[0010]在一种实施方式中，所述重组微生物是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.2所示的GF1蛋白。
[0011]在一种实施方式中，所述重组微生物是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET21a为表达载体，表达SEQ ID NO.1所示的GF1基因。
[0012]在一种实施方式中，所述重组微生物发酵获得的牡蛎铁蛋白经过纯化。
[0013]在一种实施方式中，所述纯化是将GF1粗蛋白溶液通过DEAE弱阴离子交换层析
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分子筛层析进行纯化。
[0014]在一种实施方式中，所述方法是将活性分子溶解于适当的溶剂中，与牡蛎铁蛋白溶液以活性分子：牡蛎铁蛋白为1：(100～1000)的摩尔比混合，在pH 7.0～7.5自组装20
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30min。
[0015]在一种实施方式中，所述方法是将活性分子与牡蛎铁蛋白在pH≥10的环境中以1：(100～1000)的摩尔比混合，将混合溶液的pH由≥10调整至7.0～7.5。
[0016]在一种实施方式中，所述方法是将活性分子与牡蛎铁蛋白在pH≤2的环境中以1：(100～1000)的摩尔比混合，将混合溶液的pH由≤2调整至7.0～7.5。
[0017]在一种实施方式中，所述发酵是在37℃、180～200rpm培养一定时间，再于28℃用终浓度0.4mM IPTG诱导8h。
[0018]在一种实施方式中，所述活性分子包括但不限于番茄红素(Lycopene，简写为LYC)、β
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胡萝卜素、虾青素、阿霉素或上述任一种的组合物。
[0019]本专利技术还要求保护应用所述方法制备获得的由GF1蛋白包埋活性分子的复合物。
[0020]有益效果：
[0021]本专利技术首先实现GF1蛋白将LYC分子包埋在其空腔内部，平均1个GF1蛋白笼可包埋约51个LYC分子，并能够使水体系下LYC的溶解性、稳定性和抗氧化性得到显著提升；其次，本专利技术所述的包埋方法操作快速简单，条件可控性强，应用范围广；为重组牡蛎铁蛋白及其他重组蛋白包埋活性分子提供了技术参考，为开发铁蛋白作为新型营养补充剂和铁蛋白纳米载药系统的研究等工作奠定了一定的基础。
附图说明
[0022]图1是本专利技术实施例2所述电泳纯GF1溶液的SDS
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PAGE(a)和Native
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PAGE(b)电泳鉴定结果。
[0023]图2是本专利技术实施例3所述GF1
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LYC溶液相较GF1溶液的透射电镜结果及粒径分布统计结果。
[0024]图3是本专利技术实施例3所述GF1
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LYC溶液相较GF1溶液的水动力半径拟合结果及强度相关函数。
[0025]图4是本专利技术实施例3所述GF1
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LYC溶液相较LYC和GF1的紫外
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可见全波长扫描结果。
[0026]图5是本专利技术实施例3所述GF1
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LYC溶液相较游离LYC溶液和GF1的荧光图谱。
[0027]图6是本专利技术实施例4所述GF1
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LYC溶液相较游离LYC溶液在37℃的降解动力学曲线。
[0028]图7是本专利技术实施例5所述GF1
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LYC溶液相较游离LYC溶液的DPPH清除能力比较结果。
具体实施方式
[0029]本专利技术涉及一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法，具体涉及利用体系中一定pH范围内笼形二十四聚体蛋白的可逆解离和重组来实现对脂溶性或水溶性活性分子的高效包埋的方法及应用。
[0030]以下结合实施例对本专利技术进行说明，对未特别注明的工艺参数可参照常规技术进行。
[0031]实施例1表达牡蛎铁蛋白GF1的重组菌株的构建
[0032](1)牡蛎铁蛋白GF1的基因构建和扩增
[0033]首先以牡蛎铁蛋白GF1序列(Genbank登录号NM_001305338.1)为模板，设计引物序列(GF1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可逆自组装蛋白包埋活性分子的方法，其特征在于，将牡蛎铁蛋白在pH＜6或pH＞8的溶液环境中与活性分子混合，再用酸碱调节剂将pH逐渐调节至6.8～7.5之间使牡蛎铁蛋白与活性分子自组装；所述牡蛎铁蛋白与活性分子的摩尔比为1：(10～1000)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性分子包括但不限于番茄红素、β
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胡萝卜素、虾青素或阿霉素。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酸碱调节剂包括但不限于盐酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种。4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，所述牡蛎铁蛋白是由重组微生物发酵获得。5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述方法是...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜明，夏小雨，徐献兵，吴超，李尧，李晗，王震宇，邹宇庆，浦源，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：