14-3-3η蛋白或其编码基因的新用途制造技术

本发明专利技术提供了14

【技术实现步骤摘要】
14
‑3‑3η
蛋白或其编码基因的新用途


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因的新用途，以及一种利用过表达14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因构建耐药型类风湿性关节炎动物模型的方法。

技术介绍

[0002]类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是以对称性多关节炎为主要表现的全身性免疫性疾病。其基本病理改变主要是滑膜细胞增生，炎性细胞浸润及血管翳的形成。如不予以适当的治疗，病情逐渐发展加重，最后将发生关节畸形、强直和功能丧失，导致不同程度的残疾。
[0003]非甾体抗炎药物(NSAIDs)、改善病情抗风湿药(DMARDs)和生物制剂的联合用药已提高了RA的治疗效果。但据统计，仍有1/4的患者存在耐药性，其治疗效果差，病情活动难以控制并出现进行性关节破坏及功能障碍，急需开发耐药型类风湿性关节炎动物模型以作为耐药型类风湿性关节炎治疗药物筛选平台。
[0004]现有技术中，虽然已经建立了多种动物模型，如胶原诱导性关节炎模型、胶原抗体诱导性关节炎模型、佐剂性关节炎模型、卵清蛋白诱导的关节炎模型等，但以上模型均不具备广泛适用的耐药性，尤其是佐剂性关节炎模型还存在着病变的自限性(造模大鼠4个月炎症自行消退)。
[0005]目前，没有理想的具有代表性的耐药动物模型用于耐药型类风湿性关节炎的研究。

技术实现思路

[0006]针对现有技术不足，本专利技术提供了14
‑3‑<br/>3η蛋白或其编码基因的新用途，还据此提供了一种具有耐药特征的类风湿性关节炎动物模型的制备方法。本专利技术所构建的动物模型可用于具有耐药特征的类风湿性关节炎的机制研究和药物研发中，具有极高的应用价值。
[0007]根据本专利技术的一个方面，提供了过表达14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因在构建耐药型类风湿性关节炎动物模型中的应用。
[0008]根据本专利技术的再一个方面，提供了过表达14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因在制备用于构建耐药型类风湿性关节炎动物模型的产品中的应用。
[0009]根据本专利技术的又一个方面，提供了一种利用过表达14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因构建耐药型类风湿性关节炎动物模型的方法，包括如下步骤：制备类风湿性关节炎造模动物；向所述类风湿性关节炎造模动物中导入所述14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因，获得具有类风湿性关节炎耐药临床症状的动物。
[0010]优选地，所述14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因通过重组腺病毒载体的形式导入所述类风湿性关节炎造模动物中，所述重组腺病毒载体为表达所述14
‑3‑
3η蛋白的重组腺病毒。
[0011]优选地，向所述类风湿性关节炎造模动物中导入所述14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因，包括以下步骤：将所述重组腺病毒载体按照每100g所述类风湿性关节炎造模动物5
×
109PFU的用量免疫所述类风湿性关节炎造模动物。
[0012]根据本专利技术的另一个方面，提供了一种利用过表达14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因构建耐药型类风湿性关节炎动物模型的方法，包括如下步骤：制备14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的动物；使用所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的所述动物制备类风湿性关节炎造模动物，获得具有类风湿性关节炎耐药临床症状的动物。
[0013]优选地，构建所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的动物，包括以下步骤：(1)通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA，所述gRNA的核酸序列为；GGCCGAGTCGCGAGCGACATGGG；(2)构建同源重组载体，所述同源重组载体包含Kozak
‑
tTS/rtTA
‑
BGH pA
‑
anti{TRE promoter
‑
Kozak
‑
Rat Ywhah CDS
‑3×
GGGGS
‑
EGFP
‑
rBG pA}，其中，Kozak
‑
Rat Ywhah CDS的序列为SEQ IDNo.2所示的核酸序列；(3)将所述gRNA、所述Cas9 mRNA和所述同源重组载体共同注射到所述动物受精卵中，获得F0代动物；(4)使用性成熟的所述F0代动物与野生型异性动物交配，获得所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的动物。
[0014]优选地，所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的所述动物在第4周龄时，连续7天按照30mg/kg/天的剂量向所述动物的腹腔注射四环素或强力霉素。
[0015]优选地，使用所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的动物制备所述类风湿性关节炎造模动物后，按照30mg/kg/3天的剂量向所述类风湿性关节炎造模动物的腹腔注射四环素或强力霉素。
[0016]优选地，使用性成熟的所述F0代动物与野生型异性动物交配后，还包括，经过传代，获得纯合的所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的所述动物。
[0017]优选地，通过PCR扩增和测序对所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的所述动物进行阳性鉴定，其中，所述PCR扩增的正向引物的序列为SEQ ID No.3所示的核酸序列，所述PCR扩增的反向引物的序列为SEQ ID No.4所示的核酸序列。
[0018]优选地，通过PCR扩增和测序对所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的所述动物进行阳性鉴定后，通过PCR扩增和测序对所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的所述动物进行纯合鉴定，其中，所述PCR扩增的正向引物的序列为SEQ ID No.5所示的核酸序列，所述PCR扩增的反向引物的序列为SEQ ID No.6所示的核酸序列。
[0019]本专利技术该提供了一种由以上方法构建得到的动物模型在鉴别或筛选用于治疗耐药型类风湿性关节炎的化合物中的应用。
[0020]本专利技术通过构建具有耐药特征的类风湿性关节炎动物模型，以用于具有耐药特征的类风湿性关节炎的机制的研究和药物研发，具有广泛适用的耐药性。
附图说明
[0021]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0022]图1A示出了RA患者外周血中14
‑3‑
3η的mRNA表达水平；
[0023]图1B示出了RA患者发病过程中病程与14
‑3‑
3η表达的相关性；
[0024]图2示出了关节本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.过表达14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因在构建耐药型类风湿性关节炎动物模型中的应用。2.过表达14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因在制备用于构建耐药型类风湿性关节炎动物模型的产品中的应用。3.一种利用过表达14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因构建耐药型类风湿性关节炎动物模型的方法，包括以下步骤：制备类风湿性关节炎造模动物；向所述类风湿性关节炎造模动物中导入所述14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因，获得具有类风湿性关节炎耐药临床症状的动物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因通过重组腺病毒载体的形式导入所述类风湿性关节炎造模动物中，所述重组腺病毒载体为表达所述14
‑3‑
3η蛋白的重组腺病毒。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，向所述类风湿性关节炎造模动物中导入所述14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因，包括以下步骤：将所述重组腺病毒载体按照每100g所述类风湿性关节炎造模动物5
×
109PFU的用量免疫所述类风湿性关节炎造模动物。6.一种利用过表达14
‑3‑
3η蛋白或其编码基因构建耐药型类风湿性关节炎动物模型的方法，包括以下步骤：制备14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的动物；使用所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的所述动物制备类风湿性关节炎造模动物，获得具有类风湿性关节炎耐药临床症状的动物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，构建所述14
‑3‑
3η蛋白编码基因定点敲入的动物，包括以下步骤：(1)通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA，所述gRNA的核酸序列为；GGCCGAGTCGCGAGCGACATGGG；(2)构建同源重组载体，所述同源重组载体包含Kozak
‑
tTS/rtTA
‑
BGH pA
‑
anti{TRE promoter
‑
Kozak
‑
Rat Ywhah CDS...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄锦伟，罗婉君，杨丽君，
申请(专利权)人：澳门科技大学，
类型：发明
国别省市：