一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术在微生物鉴定领域的应用，是一种基于分子生物学技术快速鉴定大肠埃希菌和泛菌DNA的试剂盒。其特点是，它包含：PCR反应体系和酶切反应体系。PCR反应体系：总体系为25μL，2

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学技术在微生物鉴定领域的应用，更具体地说，是一种基于分子生物学技术快速鉴定大肠埃希菌和泛菌DNA的检测方法。

技术介绍

[0002]大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)和泛菌(Pantoea)作为药品污染微生物中常见的细菌，为革兰氏阴性短杆菌，同属于肠道杆菌科。泛菌在自然界分布广泛，主要存在于水、土壤，最多见于植物。大肠埃希菌不仅分布广泛，还会产生有致病性的血浆凝固酶，引起人腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等症状。
[0003]传统方法中增菌培养、分离纯化、革兰染色、生化试验等鉴定技术耗时长、步骤较繁琐存在诸多不足之处。
[0004]随着分子生物学检测技术的发展，PCR技术具有敏感度高、特异性强、耗时短等优点，并在仪器设备、试剂耗材和基本操作都已十分成熟，但由于大肠埃希菌和泛菌同源性较高，普通PCR无法准确鉴别。本研究通过软件分析成功找到大肠埃希菌一处酶切位点，建立 PCR
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酶切技术，可以快速、准确的对大肠埃希菌进行鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法，其特征是，它包含：(1)特异性引物基于我们发现的大肠杆菌酶切位点使用NCBI primer
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BLAST 5.0设计一对特异性引物：Eco
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425F(正向引物)：5'GTAATACGGAGGGTGCAAGC 3'Eco
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425R(反向引物)：5'AACCACATGCTCCACCGCTT 3'(2)阳性对照品将大肠埃希菌和泛菌特异性DNA片段进行凝胶回收、纯化、连接后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，蓝白斑实验筛选阳性克隆；以质粒DNA为模板进行扩增，PCR产物送至生工生物工程有限公司测序验证，分析测序结果，并将提取的质粒经PCR鉴定后稀释一定浓度作为实验的阳性对照品。(3)鉴定反应体系45μL，包括PCR反应体系(25μL)和酶切反应体系(20μL)；阳性对照反应体系45μL；阴性对照反应体系45μL。(4)鉴定反应体系：总体系为45μL，PCR反应体系(25μL)：2
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Taq PCR Master Mix 12.5μL，待检DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.5μL，余为双蒸馏水。酶切反应体系(20μL)：取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
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M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。(5)阳性对照反应体系：总体系45μL，2
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Taq PCR Master Mix 12.5μL，大肠埃希菌克隆质粒DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.5μL，10.5μL双蒸馏水，取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
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M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。(6)阴性对照反应体系：总体系45μL，2
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Taq PCR Master Mix 12.5μL，泛菌克隆质粒DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.5μL，10.5μL双蒸馏水，取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
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M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。(4)鉴定反应条件分别将大肠埃希菌和泛菌基因组DNA加入PCR鉴定反应体系、阳性对照反应体系和阴性对照反应体系的反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：9...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云冬，王丹，赵潇颖，贾慧建，宋顺佳，姜菲菲，邵学超，赵远，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：