一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术在微生物鉴定领域的应用，是一种基于分子生物学技术快速鉴定大肠埃希菌和泛菌DNA的试剂盒。其特点是，它包含：PCR反应体系和酶切反应体系。PCR反应体系：总体系为25μL，2

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学技术在微生物鉴定领域的应用，更具体地说，是一种基于分子生物学技术快速鉴定大肠埃希菌和泛菌DNA的检测方法。

技术介绍

[0002]大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)和泛菌(Pantoea)作为药品污染微生物中常见的细菌，为革兰氏阴性短杆菌，同属于肠道杆菌科。泛菌在自然界分布广泛，主要存在于水、土壤，最多见于植物。大肠埃希菌不仅分布广泛，还会产生有致病性的血浆凝固酶，引起人腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等症状。
[0003]传统方法中增菌培养、分离纯化、革兰染色、生化试验等鉴定技术耗时长、步骤较繁琐存在诸多不足之处。
[0004]随着分子生物学检测技术的发展，PCR技术具有敏感度高、特异性强、耗时短等优点，并在仪器设备、试剂耗材和基本操作都已十分成熟，但由于大肠埃希菌和泛菌同源性较高，普通PCR无法准确鉴别。本研究通过软件分析成功找到大肠埃希菌一处酶切位点，建立 PCR
‑
酶切技术，可以快速、准确的对大肠埃希菌进行鉴定，为无菌制药企业提供技术支持。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是基于细菌16S rDNA基因片段具有高度的保守性，使用DNAMAN对大肠埃希菌和泛菌16S rDNA基因片段进行分析，发现大肠埃希菌和泛菌具有较高的同源性，且在大肠埃希菌16S rDNA基因片段存在一个酶切位点(5
’‑
A/AGCTT
‑3’
)，而泛菌不存在此位点。据此建立PCR
‑
酶切技术，通过PCR反应扩增出大肠埃希菌和泛菌相同大小的目的片段，在通过限制性内切酶Hind III对二者进行酶切鉴定，可将二者准确区分开。使用方便的大肠埃希菌与泛菌PCR
‑
酶切检测试剂盒，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并提供其简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。
[0006]本专利技术的目的是由以下技术方案来实现的：
[0007]一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法，其特征是，它包含：
[0008]1.特异性引物
[0009]基于我们发现的大肠杆菌酶切位点使用NCBI primer
‑
BLAST 5.0设计一对特异性引物：
[0010]Eco
‑
425F(正向引物)：5'GTAATACGGAGGGTGCAAGC 3'
[0011]Eco
‑
425R(反向引物)：5'AACCACATGCTCCACCGCTT 3'
[0012]2.阳性对照品
[0013]将大肠埃希菌和泛菌特异性DNA片段进行凝胶回收、纯化、连接后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，蓝白斑实验筛选阳性克隆；以质粒DNA为模板进行扩增，PCR产物送至生工生物工程有限公司测序验证，分析测序结果，并将提取的质粒经PCR鉴定后稀释一定浓度作为试剂盒的阳性对照品。
[0014]3.鉴定反应体系
[0015]鉴定反应体系45μL，包括PCR反应体系和酶切反应体系；阳性对照反应体系45μL；阴性对照反应体系45μL。
[0016](1)鉴定反应体系：总体系为45μL，PCR反应体系(25μL)：2
×
Taq PCR Master Mix 12.5 μL，待检DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.5μL，余为双蒸馏水。酶切反应体系(20μL)：取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
×
M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。
[0017](3)阳性对照反应体系：总体系45μL，2
×
Taq PCR Master Mix 12.5μL，大肠埃希菌克隆质粒DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.5μL，10.5μL双蒸馏水，取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
×
M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。
[0018](4)阴性对照反应体系：总体系45μL，2
×
Taq PCR Master Mix 12.5μL，泛菌克隆质粒 DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.5μL，10.5μL双蒸馏水，取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
×
M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。
[0019]4.鉴定反应条件
[0020]分别将大肠埃希菌和泛菌基因组DNA加入PCR鉴定反应体系、阳性对照反应体系和阴性对照反应体系的反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：95℃预变性5min； 95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环，72℃延伸10min，4℃保存。取 PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
×
M Buffer 2μL，用双蒸水补足至 20μL，37℃水浴5min，取6μL产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
[0021]5.结果判定
[0022]反应产物使用1.2％琼脂糖凝胶，在DYY
‑Ⅲ
型水平电泳仪上电泳，90V电泳50min，使用分子量100bp的DNAMarker作参照，凝胶成像分析系统观察并分析得出结果。琼脂糖凝胶电泳图谱中，泛菌基因片段在425bp处，大肠埃希菌基因片段被消化成286bp和139 bp两个片段，在与阳性对照品大肠埃希菌(286bp和139bp两个片段)凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带，空白对照无条带，可准确区分两种细菌。
具体实施方式
[0023]下面利用实施例对本专利技术作进一步描述。
[0024]一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法，其特征是，它包含以下步骤：
[0025]1.特异性引物
[0026]基于我们发现的大肠埃希菌酶切位点使用NCBI primer
‑
BLAST 5.0设计一对特异性引物：
[0027]Eco
‑
425F(正向引物)：5'GTAATACGGAGGGTGCAAGC 3'
[0028]Eco
‑
425R(反向引物)：5'AACCACATGCTCCACCGCTT 3'
[0029]2.建立鉴定反应体系
[0030](1)PCR反应：在无菌空白溶液管中加入预混好的PCR鉴定反应液24μL，同时加入相应的供试品DNA溶液1μL，混匀，做好标记。
[0031](2)酶切反应：在无菌空白溶液管中加入预混好的酶切鉴定反应液10μL，同时加入相应的供试品PCR产物10μL，混匀，做好标记，37℃水浴5min。
[0032](3)阳性对照反应：取1支无菌空白溶液管，加入预混好的PCR反应液24本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定大肠埃希菌与泛菌的方法，其特征是，它包含：(1)特异性引物基于我们发现的大肠杆菌酶切位点使用NCBI primer
‑
BLAST 5.0设计一对特异性引物：Eco
‑
425F(正向引物)：5'GTAATACGGAGGGTGCAAGC 3'Eco
‑
425R(反向引物)：5'AACCACATGCTCCACCGCTT 3'(2)阳性对照品将大肠埃希菌和泛菌特异性DNA片段进行凝胶回收、纯化、连接后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，蓝白斑实验筛选阳性克隆；以质粒DNA为模板进行扩增，PCR产物送至生工生物工程有限公司测序验证，分析测序结果，并将提取的质粒经PCR鉴定后稀释一定浓度作为实验的阳性对照品。(3)鉴定反应体系45μL，包括PCR反应体系(25μL)和酶切反应体系(20μL)；阳性对照反应体系45μL；阴性对照反应体系45μL。(4)鉴定反应体系：总体系为45μL，PCR反应体系(25μL)：2
×
Taq PCR Master Mix 12.5μL，待检DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.5μL，余为双蒸馏水。酶切反应体系(20μL)：取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
×
M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。(5)阳性对照反应体系：总体系45μL，2
×
Taq PCR Master Mix 12.5μL，大肠埃希菌克隆质粒DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.5μL，10.5μL双蒸馏水，取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
×
M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。(6)阴性对照反应体系：总体系45μL，2
×
Taq PCR Master Mix 12.5μL，泛菌克隆质粒DNA模板(10ng/μL)1μL，引物F、R(2.5ng/μL)各0.5μL，10.5μL双蒸馏水，取上述PCR产物10μL于EP管中，加入Hind III酶1μL，10
×
M Buffer 2μL，余为双蒸馏水。(4)鉴定反应条件分别将大肠埃希菌和泛菌基因组DNA加入PCR鉴定反应体系、阳性对照反应体系和阴性对照反应体系的反应管中，置于PCR反应仪中按下列程序进行：9...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云冬，王丹，赵潇颖，贾慧建，宋顺佳，姜菲菲，邵学超，赵远，
申请(专利权)人：北华大学，
类型：发明
国别省市：