一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用。本发明专利技术的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022113。本发明专利技术的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株可在作用浓度为4μM盐酸安罗替尼的培养体系中稳定生长、传代，对盐酸安罗替尼的耐药倍数(RI)为7.46倍，为研究食管癌细胞对靶向药耐药机制、寻找克服食管癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，具有重要的作用和良好的应用前景。和良好的应用前景。和良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，每年新发人数约60余万，一般在我国食管癌每年新发人数约39.6万，位居第6，其中食管鳞癌占食管癌的87％；而食管癌的每年死亡人数约19.4万，位居第5。在确诊时，近50％的患者癌症超出原发灶的局部区域范围，70％
‑
80％的切除标本在区域淋巴结中存在转移；根治性放疗、放化疗和手术后的复发率超过70％；食管癌患者总体5年生存率仅15
‑
25％。而复发转移性食管癌在系统治疗方面，目前主要的治疗方案为氟尿嘧啶为基础的双药化疗方案，同时免疫治疗的出现为食管癌的治疗带来了曙光。
[0003]然而，由于信号通路的复杂性以及尚未发现治疗相关的特异性靶点，对食管鳞癌有效的单靶点药物仍缺乏依据。多靶点药物如盐酸安罗替尼(AL3818)在食管鳞癌中表现出更好的疗效。盐酸安罗替尼(Anlotinib hydrochloride)是一种口服小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，靶向血管内皮生长因子(VEGF)受体1
‑
3，成纤维细胞生长因子(FGF)受体1
‑
4，血小板衍生生长因子(PDGF)受体
ɑ
和β、ret和c
‑
Kit，CSCO指南推荐安罗替尼可用于晚期食管鳞癌一线(安罗替尼联合化疗)或二线及以上(安罗替尼单药)治疗。尽管在临床研究中表明安罗替尼对食管患者有较好的疗效，但同样会面临耐药这一棘手问题，目前在对安罗替尼耐药机制的研究中，尚无耐药细胞株，而人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞系、构建方法及其应用暂无相关报道。
[0004]因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株及其构建方法和应用，以有助于解决或改善难以进行食管癌耐药机制研究或克服盐酸安罗替尼耐药的问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022113。
[0007]优选地，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株对盐酸安罗替尼的耐药倍数RI＝7.46。
[0008]优选地，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株对盐酸安罗替尼耐药，IC50＝36.77μM。
[0009]优选地，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株呈长梭形及多边形。
[0010]本专利技术还提出了一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的构建方法，其采用下述技术方案：如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的构建方法，包括下述步骤：(1)
将人食管癌细胞EC109培养于含有10％灭火胎牛血清和1％双抗的培养液中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养；(2)包括：A.将处于对数生长期的食管癌细胞EC109接种于培养容器中，培养至80％汇合度时，弃上清，PBS清洗，加入含0.5μM盐酸安罗替尼的培养液作用细胞1h，用PBS清洗；B.待细胞恢复正常形态后，加入含0.5μM盐酸安罗替尼的培养液作用细胞2h，用PBS清洗；C.重复步骤B，重复的过程中，含0.5μM盐酸安罗替尼的培养液作用细胞的时间依次为4h、8h、12h、24h和48h；D.待细胞稳定一个月后，MTT法检测细胞IC50值；E.将培养液中盐酸安罗替尼的浓度依次提高为1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM和4μM，循环进行步骤A
‑
D；(3)筛选得到在含4μM盐酸安罗替尼的培养液中稳定生长的细胞株，2
‑
3天更换一次培养液，细胞生长至80％
‑
90％汇合度时，传代。
[0011]本专利技术还提出了一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的应用，其采用下述技术方案：如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株在对盐酸安罗替尼耐药机制研究中的应用。
[0012]优选地，如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株在制备耐药细胞模型中的应用。
[0013]优选地，如上所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株在筛选逆转肿瘤耐药性药物或抗肿瘤药物中的应用。
[0014]有益效果：
[0015]本专利技术构建了一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，其可在作用浓度为4μM盐酸安罗替尼的培养体系中稳定生长、传代，对盐酸安罗替尼的耐药倍数(RI)为7.46倍，为研究食管癌细胞对靶向药耐药机制、寻找克服食管癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，具有重要的作用和良好的应用前景。
附图说明
[0016]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。其中：
[0017]图1为耐药细胞株形态学变化对比图；左图为亲本细胞EC109/pt的细胞形态图；右图为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818
‑
ZZ4的细胞形态图；
[0018]图2为耐药细胞株药物敏感性及耐药性检测结果图；
[0019]图3为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818
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ZZ4和其亲代人食管癌细胞EC109/pt的凋亡能力分析结果图；
[0020]图4为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818
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ZZ4和其亲代食管癌细胞EC109/pt的周期分析结果图；其中，“CN”代指盐酸安罗替尼浓度为0的情况；
[0021]图5为基因测序前后对比图；其中，上图为亲本细胞EC109/pt的基因测序结果图，中图为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818
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ZZ4的基因测序结果图，下图为耐安罗替尼的人食管癌细胞EC109/AL3818
‑
ZZ4和亲本细胞EC109/pt的基因测序对比图。
具体实施方式
[0022]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普
通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]下面将结合实施例来详细说明本专利技术。需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0024]本专利技术针对目前“尚无人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞系，不利于盐酸安罗替尼耐药机制研究和克服盐酸安罗替尼耐药”的问题，提供一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022113。
[0025]本专利技术优选实施例中，人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株对盐酸安罗替尼的耐药倍数RI＝7.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，其特征在于，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022113。2.根据权利要求1所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，其特征在于，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株对盐酸安罗替尼的耐药倍数RI＝7.46。3.根据权利要求1所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，其特征在于，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株对盐酸安罗替尼耐药，IC50＝36.77μM。4.根据权利要求1所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株，其特征在于，所述人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株呈长梭形及多边形。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的人食管癌盐酸安罗替尼耐药细胞株的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)将人食管癌细胞EC109培养于含有10％灭火胎牛血清和1％双抗的培养液中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养；(2)包括：A.将处于对数生长期的食管癌细胞EC109接种于培养容器中，培养至80％汇合度时，弃上清，PBS清洗，加入含0.5μM盐酸安罗替尼的培养液作用细胞1h，用PBS清洗；B.待细胞恢复正常...

【专利技术属性】
技术研发人员：张敏，张静，王贺，王远航，刘彦廷，路平，
申请(专利权)人：新乡医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：