一种植物非经典自噬模型的构建及其在调控植物抗性方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物非经典自噬模型的构建及其在调控植物抗性方面的应用。该植物非经典自噬模型的构建方法包括如下步骤：(1)幼苗培养：将植物种子点种于固体培养基上，常规培养5～10天，得到植物幼苗；(2)热激处理：将植物幼苗转移到液体培养基中，于40～45℃条件下加热3～10分钟，然后转移到固体培养基上，放置于22

【技术实现步骤摘要】
一种植物非经典自噬模型的构建及其在调控植物抗性方面的应用


[0001]本专利技术生物
，特别涉及一种植物非经典自噬模型的构建及其在调控植物抗性方面的应用。

技术介绍

[0002]自噬是真核细胞存在的利用溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)降解自身胞质蛋白、损伤细胞器或入侵病原菌的物质周转途径。迄今为止，研究者已鉴定出40多个自噬相关编码基因，它们协同调节自噬的发生。近来，在动物细胞中，发现一种不依赖于自噬上游核心因子参与的催化自噬蛋白ATG8锚定到单膜细胞器的过程，称之为非经典自噬。该途径在细胞内吞、病菌免疫及细胞器修复等多个生物学过程中发挥重要作用。
[0003]与经典自噬途径不同，ATG8靶向到单膜结构的非经典自噬最主要的特征是不依赖于上游调节因子如ATG1复合体及ATG9等，然而，却依赖于ATG16
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ATG5
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ATG12为核心的脂化修饰系统。此外，在经典自噬途径中，ATG8特异地与磷脂酰乙醇胺偶联，并结合到双层膜的自噬小体上。而在非经典自噬中，ATG8既可以偶联磷脂酰乙醇胺(PE)，也可以共价结合磷脂酰丝氨酸，进而锚定到单层膜的细胞器。
[0004]相比于动物领域，植物中关于非经典自噬的功能研究显著滞后，其根本原因是缺乏稳定、可靠、有效的非经典自噬模型的构建体系。因此，建立一套快速、可重复的植物非经典自噬模型，可以为探究植物非经典自噬功能提供重要的方法基础。该模型不仅有利于开发新的植物抗性性状，还可为提高植物产量提供更好的理论依据和策略。
专利
技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种植物非经典自噬模型的构建方法。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供所述植物非经典自噬模型的构建方法的应用。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种植物非经典自噬模型的构建方法，包括如下步骤：
[0009](1)幼苗培养：将植物种子点种于固体培养基上，常规培养5～10天，得到植物幼苗；
[0010](2)热激处理：将植物幼苗转移到液体培养基中，于40～45℃条件下加热3～10分钟，然后转移到固体培养基上，放置于22
±
1℃条件下恢复0.5～3小时，得到所述的植物非经典自噬模型。
[0011]步骤(1)中所述的植物为野生型植物或非ATG8脂化修饰系统相关基因突变的转基因植物，其中所述非ATG8脂化修饰系统相关基因包括ATG5、ATG7、ATG12、ATG3、ATG4和ATG10基因；本专利技术中的植物非经典自噬模型依赖于ATG8脂化修饰系统，因此，ATG5、ATG7、ATG12、ATG3、ATG4和ATG10基因均需要未发生突变(缺失)。
[0012]所述的野生型植物包括农作物、水果和烟草中的至少一种；进一步优选为水稻、草莓、烟草和拟南芥中的至少一种；再进一步优选为野生型拟南芥(拉丁学名：Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)。
[0013]所述的非ATG8脂化修饰系统相关基因突变的转基因植物中的转基因植物包括农作物、水果和烟草中的至少一种；进一步优选为转基因水稻、草莓、烟草和拟南芥中的至少一种；再进一步优选为转基因拟南芥。
[0014]所述的转基因拟南芥为过表达ATG8基因的拟南芥，ATG11基因突变(缺失)的拟南芥，ATG9基因突变(缺失)的拟南芥，ATG11基因突变(缺失)背景下过表达ATG8基因的拟南芥，ATG9基因突变(缺失)背景下过表达ATG8基因的拟南芥和过表达PIN2基因的拟南芥中的至少一种。
[0015]所述的转基因拟南芥，为了方便在荧光显微镜下进行观察，可同时转入荧光蛋白基因。
[0016]所述的荧光蛋白基因包括黄色荧光蛋白YFP基因、绿色荧光蛋白GFP基因或红色荧光蛋白mCherry基因等。
[0017]所述的ATG8基因包括ATG8a基因、ATG8b基因、ATG8c基因、ATG8d基因、ATG8e基因、ATG8f基因、ATG8g基因、ATG8h基因和ATG8i基因中的至少一种。
[0018]所述的转基因拟南芥优选为转基因拟南芥YFP
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ATG8/Col
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0，YFP
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ATG8/atg11，YFP
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ATG8/atg9和PIN2
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GFP中的至少一种；其中，
[0019]所述的转基因拟南芥YFP
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ATG8/Col
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0、YFP
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ATG8/atg11和YFP
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ATG8/atg9通过如下方法获得：
[0020](I)将荧光蛋白基因和ATG8基因通过同源重组方法构建到pCambia1300载体上，得到荧光蛋白
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ATG8融合基因的表达载体；其中，荧光蛋白基因包括YFP、GFP和mCherry基因中的至少一种；所述的ATG8基因包括ATG8a基因、ATG8b基因、ATG8c基因、ATG8d基因、ATG8e基因、ATG8f基因、ATG8g基因、ATG8h基因和ATG8i基因中的至少一种；
[0021](II)将荧光蛋白
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ATG8融合基因的表达载体利用农杆菌蘸花法分别导入到野生型拟南芥(Col
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0)、拟南芥atg11突变体或拟南芥atg9突变体中，经潮霉素抗性筛选，得到转基因拟南芥YFP
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ATG8/Col
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0、YFP
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ATG8/atg11和YFP
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ATG8/atg9。
[0022]步骤(I)所述的YFP、GFP和mCherry基因在NCBI的登录号依次为AFI26426.1，AMQ45836.1和UFQ89828.1。
[0023]步骤(I)所述的ATG8a基因、ATG8b基因、ATG8c基因、ATG8d基因、ATG8e基因、ATG8f基因、ATG8g基因、ATG8h基因和ATG8i基因在TAIR数据库中的Locus依次为AT4G21980、AT4G04620、AT1G62040、AT2G05630、AT2G45170、AT4G16520、AT3G60640、AT3G06420及AT3G15580。
[0024]步骤(II)中所述的荧光蛋白
‑
ATG8融合基因优选为YFP
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ATG8融合基因。
[0025]步骤(II)中所述的潮霉素抗性筛选通过如下方法实现：收获F0代种子，点种在含有50μmol/L潮霉素的MS培养基上，进行阳性转基因植物筛选。
[0026]步骤(II)中所述的转基因拟南芥YFP
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ATG8/Col
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0、YFP
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ATG8/atg11或YFP
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ATG8/atg9优选为T3代纯合种子。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)幼苗培养：将植物种子点种于固体培养基上，常规培养5～10天，得到植物幼苗；(2)热激处理：将植物幼苗转移到液体培养基中，于40～45℃条件下加热3～10分钟，然后转移到固体培养基上，放置于22
±
1℃条件下恢复0.5～3小时，得到所述的植物非经典自噬模型。2.根据权利要求1所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：步骤(1)中所述的植物为野生型植物或非ATG8脂化修饰系统相关基因突变的转基因植物，其中所述非ATG8脂化修饰系统相关基因包括ATG5、ATG7、ATG12、ATG3、ATG4和ATG10基因；步骤(2)中所述的热激的温度为43～45℃；步骤(2)中所述的热激的时间为5～10分钟。3.根据权利要求2所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：所述的野生型植物为农作物、水果和烟草中的至少一种；进一步为水稻、草莓、烟草和拟南芥中的至少一种；再进一步为野生型拟南芥；所述的非ATG8脂化修饰系统相关基因突变的转基因植物中的转基因植物为农作物、水果和烟草中的至少一种；进一步为转基因水稻、草莓、烟草和拟南芥中的至少一种；再进一步为转基因拟南芥；步骤(2)中所述的热激的温度为45℃；步骤(2)中所述的热激的时间为5分钟。4.根据权利要求3所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：所述的转基因拟南芥为过表达ATG8基因的拟南芥，ATG11基因突变的拟南芥，ATG9基因突变的拟南芥，ATG11基因突变背景下过表达ATG8基因的拟南芥，ATG9基因突变背景下过表达ATG8基因的拟南芥和过表达PIN2基因的拟南芥中的至少一种；所述的ATG8基因包括ATG8a基因、ATG8b基因、ATG8c基因、ATG8d基因、ATG8e基因、ATG8f基因、ATG8g基因、ATG8h基因和ATG8i基因中的至少一种。5.根据权利要求4所述的植物非经典自噬模型的构建方法，其特征在于：所述的转基因拟南芥为转基因拟南芥YFP
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ATG8/Col
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0，YFP
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ATG8/atg11，YFP
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ATG8/atg9和PIN2
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GFP中的至少一种；其中，所述的转基因拟南芥YFP
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ATG8/Col
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0、YFP
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ATG8/atg11和YFP
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ATG8...

【专利技术属性】
技术研发人员：周俊，高彩吉，郑轩昂，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：