大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs及其应用，大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs包括GmelPBP1、GmelPBP2和GmelPBP3，GmelPBP1、GmelPBP2和GmelPBP3均为分泌蛋白，属于ClassicalOBP亚家族，具有PBP

【技术实现步骤摘要】
大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs及其应用。

技术介绍

[0002]目前，在长期的进化过程中，昆虫形成了高度灵敏的嗅觉系统，并以此来感受空气中的挥发性物质，寻找配偶、食物和栖息场所等。昆虫性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins，PBPs)作为嗅觉系统的成分之一，它与进入感器腔内的脂溶性信息素分子特异性结合，并携带其穿过亲水性的淋巴液，送到嗅觉神经树突末梢，从而启动昆虫的寻偶和交配行为，在昆虫性信息素识别及嗅觉信号传导过程中起到了关键的作用。大蜡螟(Galleria mellonella L.)属鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)蜡螟亚科(Galleriinae)蜡螟属Galleria昆虫，其幼虫以蜜蜂巢脾为食，容易在长时间不清扫的蜂群和长时间存放不加以处理的巢脾上滋生、钻蛀隧道、吐丝作茧，破坏巢脾、蛀坏蜂具，在蜂群中造成蜜蜂的幼虫和蛹死亡，出现“白头蛹”，扰乱蜜蜂在蜂群中的正常活动，若不及时处理，整个蜂群会弃巢而逃。大蜡螟给养蜂业带来了巨大的危害，是蜜蜂尤其是东方蜜蜂(Apis cerana)最主要的敌害之一。
[0003]在昆虫中，第一个PBP是Vogt and Riddiford(1981)年用标记性信息素的方法在多音天蚕蛾Antheraea polyphemus雄蛾触角中发现的，因其能特异性地结合带放射性标记的性信息素而被命名为PBP。PBPs属于气味结合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)亚家族，具有OBPs类似的基本特征，是一类小分子酸性蛋白，氨基酸中存在6个保守的半胱氨酸位点，两两形成3个二硫键，对蛋白质的立体结构起到一定的支撑作用。目前，已从40多种昆虫中克隆得到了60多种PBPs基因，涉及鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和蜚蠊目等。研究发现，在同一物种中存在多种PBPs，即PBP1、PBP2和PBP3，它们被不同的基因座编码，氨基酸序列同源性在32％～92％之间。PBPs广泛分布于昆虫的化学感器中，主要识别性外激素，最早认为PBPs在雄虫触角中特异性表达，近年来发现PBPs除在触角中大量表达外，在其它组织中也有发现。孙梦婧等对小菜蛾不同组织进行检测，发现3个PxylPBPs不仅在化学感受组织如触角、喙、唇须中有表达，同时在雌性的生殖和雄性的足中也有少量表达。小地老虎AipsPBP1
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3在喙和下唇须中也有少量的表达。斜纹夜蛾SlitPBP1和SlitPBP2在雌雄性触角中均有表达，而SlitPBP3不仅在触角中有表达，在去除触角的雄性个体中也有少量的表达。家蚕BmorPBP具有明显的时空表达差异性，触角中表达水平较高，而其它非嗅觉组织中鲜有表达。欧洲玉米螟与亚洲玉米螟其PBP2与PBP3在头部有适度表达。大螟SinfPBPs 3个基因在雄性触角中的表达量呈现极大差异，而在雌雄触角中差异不显著。对于PBPs在雌虫中的作用目前研究的还不是很清楚，推测其可能与识别雄性信息素或检测自身释放的信息素有关。荧光竞争结合试验(fluorescence competitive binding assay)是通过荧光探针1
‑
NPN来勘测蛋白与气味配体结合能力的一种较为普遍的方法，大蜡螟性信息素目前已被鉴定出来的成分包括十一烷醛(n
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undecanal)、壬醛(n
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nonanal)、5,11
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二甲基
‑
十五烷(5,
11
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dimethyl
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pentadecane)。
[0004]与绝大多数鳞翅目昆虫由雌性信息素介导求偶行为不同的是，大蜡螟由雄蛾产生性信息素吸引雌蛾交配。目前，有关大蜡螟PBPs的相关研究尚未见报道。另外，目前常用的性诱剂存在只能诱捕雄虫的缺陷。
[0005]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0006](1)目前有关大蜡螟PBPs的相关研究尚未见报道。
[0007](2)目前常用的性诱剂存在只能诱捕雄虫的缺陷。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs及其应用。
[0009]本专利技术是这样实现的，一种大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs，所述大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs包括GmelPBP1、GmelPBP2和GmelPBP3，所述大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBP1、GmelPBP2和GmelPBP3的cDNA序列分别为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3。
[0010]GmelPBP1
[0011]ATGTCAAAGAGAATCGTTATAGTAGTGTTCATTTATTTAGCCATAGAACCAAGTACTGACGCGTCACAGGATATTATGAAGGAACTTATGGTGAATTTCGTTAAAGCTTTTGATATTTGTAAAAAAGAGTTGGATCTTCCGAATACAGTTCATGCAGACTTTTATAATTTCTGGAAGGAGGAATATGAAATTACACATAGACAAACCGGCTGCGCAATAAAATGCCTCTCCGCAAAACTGGACCTCATAGATCCTGAAGGAAAGCTTCGACATGGCAATGCTCAGAAATTCGCCATGGAATACGGTGCTGATGAAAACATGGCGAATCAAGTCGTCGATCTTATTCATGCATGCGAAAAGTCATTCCCGTCTAATGACGATGAATGCATGAGAATATTGAACATCACCAACTGTTTCAAGACTGAGATACACAAATTAAAATGGGCACCTGACATGATTCTCCTAGTTGGAGAGATACTATTAGAATATTAA
[0012]GmelPBP2
[0013]ATGGGGATAAGAAGCAAATTGGGTGTAATCGCGTTTTGTCTGACGTGTTTATTGTTACACGTCCGTAGGGCAAATTCCTCAGCTGAAGTGGTGAAGAAACTCAGCGTCACCTTTGCCAAAGCAATGGATGCATGTAAAAAGGAGTTAAACGTGGGAGACCACATACTGCAAGAGATGCAGAACTTCTGGCGCGAAGAGTACGACCTGGTGCACCGCGACACCGGCTGTATGCTGACCTGCATGGCGGCTAAACACGACCTGATCGTTATTACAGAAGATCGGATGCACCACGAGAACGCCCATGCGTTCGCGAAAGCTCACGGCGCTGACGACGACTTGGCCAAGCAAATAGTAACTATGTTACACGATTGTGAATCCGATAATCCTCAGCAGGAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs，其特征在于，所述大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs包括GmelPBP1、GmelPBP2和GmelPBP3，所述大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBP1、GmelPBP2和GmelPBP3的cDNA序列分别为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3。2.如权利要求1所述的大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs，其特征在于，所述大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBP1、GmelPBP2和GmelPBP3的cDNA序列的完整开放阅读框长度分别为492bp、510bp和492bp，各编码163、169、163个氨基酸，预测分子量分别为18.79、19.12和18.35kD；3个蛋白序列中均含有6个保守半胱氨酸Cys位点，N
‑
末端均有一段信号肽序列。3.如权利要求1所述的大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs，其特征在于，所述GmelPBP1、GmelPBP2和GmelPBP3均为分泌蛋白，属于Classical OBP亚家族，具有PBP
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GOBP家族的典型结构；所述GmelPBP1、GmelPBP2和GmelPBP3的表达具有组织特异性，GmelPBP2和GmelPBP3在大蜡螟雌蛾中高表达，参与雄性大蜡螟性信息素的识别过程。4.一种实施如权利要求1～3任意一项所述的大蜡螟性信息素结合蛋白基因GmelPBPs的鉴别GmelPBPs在大蜡螟嗅觉识别中的分子机制的方法，其特征在于，所述鉴别GmelPBPs在大蜡螟嗅觉识别中的分子机制的方法包括：以大蜡螟触角cDNA为模板，通过RT
‑
PCR技术扩增和克隆获得GmelPBPs的cDNA序列；利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性；采用MEGA5.2软件中邻接法构建系统进化树；通过qRT
‑
PCR技术检测GmelPBPs在大蜡螟不同发育阶段和成虫不同组织中的表达差异；通过荧光竞争结合试验确定GmelPBPs在大蜡螟嗅觉识别中的分子机制；所述大蜡螟不同发育阶段包括卵、幼虫、蛹和成虫，所述成虫不同组织包括触角、头、胸、腹、足和翅膀。5.如权利要求4所述的鉴别GmelPBPs在大蜡螟嗅觉识别中的分子机制的方法，其特征在于，所述鉴别GmelPBPs在大蜡螟嗅觉识别中的分子机制的方法包括以下步骤：步骤一，总RNA的提取及cDNA第一链的合成；步骤二，设计引物并进行GmelPBPs的cDNA克隆；步骤三，GmelPBPs序列的生物信息学分析；步骤四，荧光定量PCR反应；步骤五，重组大蜡螟GmelPBPs蛋白的诱导及分离纯化；步骤六，荧光竞争结合试验。6.如权利要求5所述的鉴别GmelPBPs在大蜡螟嗅觉识别中的分子机制的方法，其特征在于，所述步骤一中的总RNA的提取及cDNA第一链的合成包括：利用RNAiso Plus试剂盒提取各组织样本总RNA；在测定浓度和纯度后，再根据PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录合成cDNA第一链，
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20℃保存备用或直接进行试验；其中，不同发育阶段和不同组织cDNA模板用于荧光定量PCR反应；大蜡螟触角cDNA模板用于目的基因的克隆；所述步骤二中的引物设计包括：使用Primer Premier 5.0软件设计引物扩增PBPs的cDNA序列；根据克隆得到的序列预测基因的开放阅读框，并设计特异性引物用于荧光定量PCR；选择Ef
‑
1α序列作为内参基因，所述引物包括：在基因克隆中，基因GmelPBP1的引物序列为SEQ ID NO：4，GmelPBP2的引物序列为SEQ ID NO：5，GmelPBP3的引物序列为SEQ ID NO：6；
在荧光定量PCR中，基因GmelPBP1的引物序列为SEQ ID NO：7，GmelPBP2的引物序列为SEQ ID NO：8，GmelPBP3的引物序列为SEQ ID NO：9；在原核表达中，基因GmelPBP1的引物序列为SEQ ID NO：10，GmelPBP2的引物序列为SEQ ID NO：11，GmelPBP3的引物序列为SEQ ID NO：12；所述步骤二中的GmelPBPs的cDNA克隆包括：以大蜡螟触角cDNA为模板，使用2
×
Es Taq MasterMix试剂盒在PCR扩增仪上进行扩增；PCR反应体系：cDNA模板2μL，2
×
Es Taq MasterMix 10μL，上、下游引物10μmol
·
L
‑1各1μL，RNase
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Free Water 6μL，总体系为20μL；反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸8min；PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，将目的片段进行切胶，并利用E.Z.D.ATM Gel Extraction Kit试剂盒进行DNA回收后再进行双向测序。7.如权利要求5所述的鉴别GmelPBPs在大蜡螟嗅觉识别中的分子机制的方法，其特征在于，所述步骤三中的GmelPBPs序列的生物信息学分析包括：运用ProtParam预测蛋白的分子量、等电点等理化性质；SignalP 4.1预测信号肽序列；利用DNAMAN软件进行氨基酸的多序列比对，采用MEGA5.2软件中的邻接法构建系统发育树，Bootrap为1000次；所述步骤四中的荧光定量PCR反应包括：以大蜡螟不同发育阶段和不同组织的样品cDNA为模板，使用Premix Ex TaqTM II试剂盒进行荧光定量PCR；反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM II 2
×
10μL，ROX Reference Dye II 2
×
0.4μL，上、下游引物10μmol
·
L
‑1各0.8μL，cDNA模板2μL，灭菌超纯水6μL；反应条件：95℃预变性30s；接着进行45个循环：95℃30s，60℃34s；测定熔解曲线的反应条件：以0.5℃的升温速度从60℃升至95℃；每个样品进行3次平行重复；荧光定量结果应用MXPro
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MX3000P软件进行分析处理；根据标准曲线及荧光曲线的Ct值，采用2
‑△△
Ct
法进行数据分析；采用SPSS17...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨爽，朱雅楠，梁铖，张洋逸，苗春辉，赵洪木，李雨时，
申请(专利权)人：云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：