信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针，具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列。本发明专利技术通过对EGFP生色团附近的氨基酸进行突变，将EGFP改构成对Hg

【技术实现步骤摘要】
信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针及其制备与应用


[0001]本专利技术属于分子生物领域。更具体地说，本专利技术涉及一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针及其制备与应用。

技术介绍

[0002]汞不能通过生态系统的自我调节来降解，而是通过食物链等形式不断积累流传，最终进入人体，再跟着血液流动流向全身。汞对人体神经系统、肾、脑组织等具有严重的影响和危害。汞离子进入人体造成中毒后，会表现出神经衰弱、中毒性脑病、汞毒性震颤等症状。因此，找到一种简单、快速、选择性好、灵敏度高等的Hg
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检测方法对环境保护和人体健康都具有重要意义。目前，常用来检测Hg
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的技术有冷原子吸收光谱法(CV
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AAS)，电感耦合等离子体质谱法(ICP
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MS)，原子荧光光谱法(AFS)，小分子荧光探针等。
[0003]绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)在20世纪60年代初由Osamu Shimom ura首次从水母Aequorea victorea中发现并分离，后因其具有生理稳定性和新颖的荧光特性而被广泛研究。绿色荧光蛋白由238个氨基酸残基组成，分子质量约为27kDa。GFP由11条β
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折叠链围成，外形呈圆柱桶状，在桶的中心穿过一条α
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螺旋，在α
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螺旋上有可发光的发色团被α
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螺旋固定在桶的正中心。发色团包含第65、66、67位氨基酸(Ser65<br/>‑
Tyr66
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Gly67)。GFP的最大激发光波长约486nm，最大发射光波长约506nm，当有足够能量激发时，发色团将会发出绿色荧光。增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP，EGFP)由GFP经过氨基酸突变而得，突变氨基酸为F64L S65T。EGFP较GFP来说，发色团成熟得更快，荧光更强。EGFP的荧光光谱具有一定的稳定性，几乎不受环境、附加分子等影响，是应用最广泛的荧光蛋白之一。
[0004]目前，利用绿色荧光蛋白检测汞离子已有大量的研究报道，如CN110241064A
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一种用于汞离子检测的核酸蛋白复合物变构型微生物全细胞传感器的构建及其应用、CN101921724A
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一种用于监测环境中Hg
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污染的重组工程菌及其应用等，然而这些研究报道均为通过构建含Hg
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识别的启动子，在Hg
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存在的条件下，启动绿色荧光蛋白或增强型绿色荧光蛋白的表达以实现汞离子检测的目的。可见，目前的方法都为通过绿色荧光蛋白或增强型绿色荧光蛋白的表达间接实现对Hg
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的检测，存在着检测周期长、灵敏度低等问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0006]本专利技术还有一个目的是提供一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针，其能够利用增强型绿色荧光蛋白的203位和205位半胱氨酸残基与Hg
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配位，引起发色团周围电子环境发生变化，造成荧光信号的改变而实现对Hg
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的检测。
[0007]为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针，为下列氨基酸序列之一：
[0008]1)具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列；
[0009]2)SEQ ID No.1经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有与汞离子结合能力以及绿色荧光特性的氨基酸序列。
[0010]一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的制备方法，将增强型绿色荧光蛋白发色团附近的203位、205位氨基酸突变为能与Hg
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特异性结合的半胱氨酸，即得所述信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针。
[0011]优选的是，信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的制备方法，包括以下步骤：
[0012]1)利用引物扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列；
[0013]2)将DNA序列与质粒pET30a连接，构建EGFP
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pET30a表达载体；
[0014]3)利用PCR技术对载体EGFP
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pET30a进行突变扩增，扩增产物与DpnI酶反应去除模板质粒，取酶切获得的突变质粒转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆送去测序，获得正确突变的表达载体，利用正确突变的表达载体在工程菌中表达，获得信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针。
[0015]一种试剂盒，包含上述信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针。
[0016]一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针在汞离子检测中的应用。
[0017]一种编码信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的核苷酸序列，为下列核苷酸序列之一：
[0018]1)具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列；
[0019]2)编码SEQ ID No.1经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有与汞离子结合能力以及绿色荧光特性蛋白的核苷酸序列。
[0020]一种编码信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的核苷酸序列的制备方法，包括以下步骤：
[0021]1)利用引物扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列；
[0022]2)将DNA序列与质粒pET30a连接，构建EGFP
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pET30a表达载体；
[0023]3)利用PCR技术对载体EGFP
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pET30a进行突变扩增，扩增产物与DpnI酶反应去除模板质粒，取酶切获得的突变质粒转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆送去测序，获得正确突变的表达载体，即获得编码信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的DNA。
[0024]一种表达载体，包括载体质粒和与载体质粒操作性连接的编码上述氨基酸序列的核苷酸序列或者上述核苷酸序列，所述表达载体包括原核表达载体、真核表达载体或病毒载体。
[0025]一种宿主细胞，其特征在于，包含上述的表达载体。
[0026]本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术通过对EGFP生色团附近的氨基酸进行突变，将EGFP改构成对Hg
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敏感的生物传感器，即将EGFP发色团附近的203位、205位氨基酸突变为能与Hg
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特异性结合的半胱氨酸，将得到的荧光蛋白双突变体EGFP T203CS205C转化到大肠杆菌中表达。当在表达后的大肠杆菌中加入Hg
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时，203位和205位半胱氨酸残基会和Hg
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配位，引起发色团周围电子环境发生变化，从而造成荧光信号的改变。
[0027]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0028]图1为本专利技术EGFP
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针，其特征在于，为下列氨基酸序列之一：1)具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列；2)SEQ ID No.1经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有与汞离子结合能力以及绿色荧光特性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的制备方法，其特征在于，将增强型绿色荧光蛋白发色团附近的203位、205位氨基酸突变为能与Hg
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特异性结合的半胱氨酸，即得所述信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针。3.如权利要求2所述的信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用引物扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列；2)将DNA序列与质粒pET30a连接，构建EGFP
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pET30a表达载体；3)利用PCR技术对载体EGFP
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pET30a进行突变扩增，扩增产物与DpnI酶反应去除模板质粒，取酶切获得的突变质粒转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆送去测序，获得正确突变的表达载体，利用正确突变的表达载体在工程菌中表达，获得信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针。4.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针。5.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹，严一语，韦敏，黄金妙，
申请(专利权)人：南宁师范大学，
类型：发明
国别省市：