基于胶乳免疫比浊法测定S100A8/9的试剂盒及方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种基于胶乳免疫比浊法测定S100A8/9的试剂盒及方法。本发明专利技术提供的基于胶乳免疫比浊法测定S100A8/9的试剂盒，能有效提高检测S100A8/9的灵敏度和特异性，重复性更好，抗干扰能力强，且试剂稳定性良好，实现了在生化分析仪上的自动检测，操作简单、检测方便快捷，便于临床推广。另外，本发明专利技术提供的试剂盒对肺癌和纤维化进程检测也更加方便，有利于对肿瘤标志物和预后标志物的检测。利于对肿瘤标志物和预后标志物的检测。利于对肿瘤标志物和预后标志物的检测。

【技术实现步骤摘要】
基于胶乳免疫比浊法测定S100A8/9的试剂盒及方法


[0001]本专利技术实施例涉及生物分析
，具体涉及一种基于胶乳免疫比浊法测定S100A8/9的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]S100A8(MRP8)和S100A9(MRP14)是钙离子结合蛋白，属于S100家族的结合蛋白。这个家族的成员包含一个共同的结构，由两个“EF手形”基序组成，它们本身由两个α链组成，由一个肽环分离，其中离子Ca
2+
可以结合。在两个“EF手形”基序之间，S100蛋白之间存在一个铰链区变量，通常赋予不同S100蛋白的生物学活性和特异性。它们通常以异源二聚体的形式存在，而同源二聚体由于稳定性而很少存在。它们组成性地表达在髓系细胞的细胞质中，包括髓系前体细胞、多核中性粒细胞(PNN)和单核细胞，但在淋巴细胞中不表达。它们出现在早幼粒细胞阶段，在成熟的粒细胞中达到最大，占胞质总蛋白的40％。在生理条件下，当单核细胞分化为巨噬细胞时，它们就会消失。S100A8/A9在嗜中性粒细胞和单核细胞中组成性地表达为Ca
2+
传感器，参与细胞骨架重排和花生四烯酸代谢。在炎症期间，S100A8/A9被主动释放，并通过刺激白细胞募集和诱导细胞因子分泌在调节炎症反应中发挥关键作用。S100A8/A9是诊断和随访的候选生物标志物，也是炎症相关疾病治疗反应的预测指标。由于使用小分子抑制剂或抗体阻断S100A8/A9活性可改善小鼠模型中的病理状况，因此异源二聚体具有作为治疗靶标的潜力。S100A8/A9已被发现在许多疾病中起重要作用，如炎症、癌症，甚至可以用作诊断疾病或预测疾病进展的典型或非典型标志物。这些发现促使研究人员探索S100A8/A9是否可以用作炎症和癌症以外的疾病的生物标志物或治疗靶标。可以作为一个强大的放大器的炎症在自身免疫以及在癌症发展和肿瘤扩散。iNOS
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S100A8/A9转亚硝基酶复合物通过识别[IL]‑
x
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C
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x
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x
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[DE]基序，指导GAPDH的选择性炎症刺激依赖性S
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亚硝基化，可能是ANXA5、EZR、MSN和VIM等多个靶点；S100A8似乎有助于S
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亚硝基化位点的选择性。
[0003]总的来说，S100A8和A9蛋白被认为是警报素，否则称为损伤相关分子模式(DAMP)。在炎症条件下，S100A8和S100A9的蛋白表达在多种细胞中被诱导，如内皮细胞、巨噬细胞、破骨细胞、角质形成细胞和树突状细胞。因此，血清S100A8和/或S100A9水平升高在许多炎症病理(银屑病、类风湿关节炎、慢性炎症性肠病等。)中被发现。S100A8和S100A9还可以通过与TLR4受体连接并诱导NF
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κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，通过分泌促炎细胞因子(TNF、IL6等。)来放大炎症反应。它们也参与ROS依赖的NLRP3炎症小体的激活。除了它们的活性在细胞因子分泌，他们发挥了化学吸引功能，允许招募和白细胞粘附。细胞黏附的过程是通过S100A8和/或A9固定在中性粒细胞TLR4上，提高内皮细胞表达细胞间黏附分子1(IntercellularAdhesion Molecule 1，ICAM
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1)和血管细胞黏附蛋白1(Vascular cell adhesionprotein 1，VCAM
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1)黏附分子，使白细胞黏附于内皮壁。炎症反应在肿瘤发生发展中的重要作用在很大程度上解释了S100A8和A9在肿瘤发生发展中的作用。文献中有充分的证据支持S100A8和A9在许多实体癌中的促癌作用。首先，S100基因1q21位点的扩增在癌症
中普遍存在。此外，S100A8和S100A9蛋白在多种实体瘤中促进肿瘤生长、转移发展、血管生成和免疫逃逸。事实上，S100A8和S100A9蛋白的表达在几种肿瘤类型(乳腺、前列腺、结肠、黑色素瘤等。)中上调。S100A8已被证明在侵袭性表型和总生存率低的患者中过表达，表明调节S100A8基因表达是参与癌细胞控制的一种机制。蛋白质S100A8、S100A9或异源寡聚体S100A8/A9也可能通过调节肿瘤微环境促进癌细胞迁移和扩散。同样，关于S100A8和S100A9在血液系统恶性肿瘤尤其是急性白血病(AL)发生发展中的病理作用的数据也越来越多。
[0004]Ebbing等人研究了肾肿瘤患者钙卫蛋白的时变变化，这些变化由于肾动脉的短暂钳夹而导致医源性肾缺血再灌注损伤。钙卫蛋白浓度在手术结束时(缺血后约2小时)开始显着增加，术后48小时达到最大水平，钙卫蛋白水平比基线增加69倍。手术后5天钙卫蛋白仍然显着增加。钙卫蛋白的升高已经在其他几种疾病中进行了描述，例如类风湿性关节炎，炎症性肠病，心肌梗塞，癌症和其他几种疾病。在尿钙卫蛋白发现的临床解释中，人们应该意识到，除了AKI之外，还有两种临床环境导致钙卫蛋白的增加：由于钙卫蛋白主要来自中性粒细胞和单核细胞，脓尿会大大增加尿钙卫蛋白。此外，尿路上皮癌与浓度增加有关。
[0005]目前S100A8/9的检测方法主要是酶联免疫吸附法(ELISA)，ELISA法操作相对繁琐、检测时间长，干扰因素较多，而在生化分析仪上利用胶乳免疫比浊法测定S100A8/9，操作简单、检测方便快捷、灵敏度高，特异性强，重复性也好，且该测试方法可以在各种生化分析仪上使用，具有很强的适用性。

技术实现思路

[0006]为此，本专利技术实施例提供一种基于胶乳免疫比浊法测定S100A8/9的试剂盒及方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：
[0008]根据本专利技术实施例的第一方面，本专利技术提供一种包被有S100A8/9抗体的胶乳微球溶液的制备方法，包括如下步骤：
[0009]1)向缓冲液加入胶乳微球，得活化的胶乳微球体系；
[0010]2)向所述活化的胶乳微球体系加入S100A8/9抗体，搅拌，之后加入EDC
·
HCl溶液和NHS溶液，进行偶联反应，得偶联体系；
[0011]3)向所述偶联体系加入封闭液进行封闭，之后进行离心，取上清，得混合体系；
[0012]4)向所述混合体系加入储存液，过夜保存，得所述包被有S100A8/9抗体的胶乳微球溶液；
[0013]其中，所述缓冲液由体积比为1：3～5的MES缓冲液和硼酸缓冲液组成，所述MES缓冲液以水为溶剂，包括MES
·
H2O 6.0～7.0g/L、NaOH 4.5～5.5g/L，pH为6.0～6.5；所述硼酸缓冲液以水为溶剂，包括硼酸3.0～3.2g/L、四硼酸钠1.4～1.6g/L，pH为7.2～7.5。
[0014]本专利技术发现，在采用“二步法”进行偶联反应，缓冲液、物料的添加方式显著影响S100A8/9抗体与胶乳微球的结合，胶乳微球在上述特定缓冲液中进行活化，之后加入S100A8/9抗体，再加入EDC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包被有S100A8/9抗体的胶乳微球溶液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)向缓冲液加入胶乳微球，得活化的胶乳微球体系；2)向所述活化的胶乳微球体系加入S100A8/9抗体，搅拌，之后加入EDC
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HCl溶液和NHS溶液，进行偶联反应，得偶联体系；3)向所述偶联体系加入封闭液进行封闭，之后进行离心，取上清，得混合体系；4)向所述混合体系加入储存液，过夜保存，得所述包被有S100A8/9抗体的胶乳微球溶液；其中，所述缓冲液由体积比为1：3～5的MES缓冲液和硼酸缓冲液组成，所述MES缓冲液以水为溶剂，包括MES
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H2O6.0～7.0g/L、NaOH4.5～5.5g/L，pH为6.0～6.5；所述硼酸缓冲液以水为溶剂，包括硼酸3.0～3.2g/L、四硼酸钠1.4～1.6g/L，pH为7.2～7.5。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶乳微球为羧基聚苯乙烯胶乳颗粒，粒径为140～160nm；所述胶乳微球与缓冲液的体积比为1：3.8～4.2。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S100A8/9抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第26
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33位氨基酸所示；所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51
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58位氨基酸所示；所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第97
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110位氨基酸所示；所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第26
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31位氨基酸所示；所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第49
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51位氨基酸所示；所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第88
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97位氨基酸所示。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述S100A8/9抗体的终浓度为0.04～0.06mg/ml；所述EDC
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HCl的终浓度为1.8～2.2mM；所述NHS的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝立颖，彭勇，韩豪杰，
申请(专利权)人：北京世纪沃德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：