一种PCR检测载体和构建方法技术

本发明专利技术涉及PCR检测载体和构建技术领域，尤其涉及一种PCR检测载体和构建方法，针对当前现有的PCR检测载体和构建技术仍存在载体构建过程大都采用直接构建，缺少测序验证过程，使得构建的PCR检测载体存在错误，导致构建的PCR检测载体的检测正确率较低的问题，现提出如下方案，其中一种PCR检测载体包括以下重量份的原料：载体5

【技术实现步骤摘要】
一种PCR检测载体和构建方法


[0001]本专利技术涉及PCR检测载体和构建
，尤其涉及一种PCR检测载体和构建方法。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，在很大程度上代替了传统的DNA克隆方法，利用该技术能够从复杂的DNA分子群体中选择性地复制一段特异的序列，使某一DNA片段得到特异性的扩增。PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核昔酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，双链DNA的高温变性、引物与模板的低温退火和适温下引物延伸三个步聚反复循环，每一循环中所合成的新链又都可以作为下一循环的模板。PCR的特定DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，达到迅速大量扩增的目的。PCR技术已在分子生物学、医学、法学、生物化学等领域得到了广泛应用，具有广阔的发展前景。
[0003]但是目前现有的PCR检测载体和构建技术仍存在载体构建过程大都采用直接构建，缺少测序验证过程，使得构建的PCR检测载体存在错误，导致构建的PCR检测载体的检测正确率较低的问题，因此，我们提出一种PCR检测载体和构建方法用于解决上述问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决目前现有的PCR检测载体和构建技术仍存在载体构建过程大都采用直接构建，缺少测序验证过程，使得构建的PCR检测载体存在错误，导致构建的PCR检测载体的检测正确率较低等问题，而提出的一种PCR检测载体和构建方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种PCR检测载体，包括以下重量份的原料：载体5
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15份、特异性引物10
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30份、高保真酶7
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18份、小鼠光感受器细胞cDNA12
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22份、1％琼脂糖凝胶13
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47份、连接产物10
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25份、DH5a感受态细菌20
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27份；
[0007]其构建方法包括以下步骤：
[0008]S1：载体选择：由专业人员进行载体选择，并通过选定的目的基因，设计特异性引物；
[0009]S2：PCR扩增：特异性引物设计完成后由专业人员利用高保真酶进行PCR扩增；
[0010]S3：酶切反应：由专业人员对载体和目标片段进行限制性酶切反应；
[0011]S4：连接转化：进行连接转化；
[0012]S5：PCR验证：由专业人员挑取阳性克隆进行PCR验证；
[0013]S6：构建PCR检测载体：测序验证完成后由专业人员通过测序验证结果进行处理构建PCR检测载体；
[0014]S7：进行使用：由专业人员对所述构建的PCR检测载体进行使用；
[0015]优选的，所述S1中，由专业人员进行载体选择，其中进行载体选择时由专业人员根
据所要构建的PCR检测载体的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体，并通过选定的目的基因，设计特异性引物，其中进行引物设计时基因序列为Nrf2则特异性引物为Nrf2pC1EcoR
‑
F为CGGAATTCCGCCACCATGATGGACTTGGAGTTGCCACC以及
[0016]Nrf2pC1BamH
‑
R为CGGGATCCCTAGTTTTTCTTTGTATCTGGCTTCTTGC；
[0017]优选的，所述S2中，特异性引物设计完成后由专业人员利用高保真酶进行PCR扩增，其中进行PCR扩增时以小鼠光感受器细胞cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，并在引物两端分别引入EcoRI和BamHI的酶切位点，同时通过1％琼脂糖凝胶回收目的基因DNA条带；
[0018]优选的，所述S3中，由专业人员对载体和目标片段进行限制性酶切反应，其中进行限制性酶切反应时质粒载体Plvx
‑
DsRed
‑
monomer
‑
C1和目的基因PCR产物的EcoRI和BamHI双酶切，且所述酶切反应的反应条件为在37℃水浴反应2h，其中所述酶切反应完成后通过1％琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒Plvx
‑
DsRed
‑
monomer
‑
C1酶切大片段和目的基因酶切片段；
[0019]优选的，所述S4中，进行连接转化，其中进行连接转化时质粒Plvx
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DsRed
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monomer
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C1 EcoRI+BamHI酶切回收大片段与目的基因连接，连接反应条件为在16℃反应12h，且进行连接反应时由专业人员取10ul连接产物与100ul DH5a感受态细菌混匀后冰浴30min，并在42℃热激90s，热激完成后放置冰上静置5min，静置完成后加入预先预热至室温的700ul LB培养基中，并在37℃恒温条件下摇床培养50min，培养完成后吸取200ul的菌液，并采用移液器混匀后均匀涂布于含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上，并在37℃恒温培养箱倒置培养过夜；
[0020]优选的，所述S5中，由专业人员挑取阳性克隆进行PCR验证，其中进行验证时先由专业人员挑取5个单菌落接种于含5ml、100ug/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，并在300rpm，37℃恒温条件下摇床培养过夜，同时由专业人员对过夜的菌液进行扩增，选择阳性菌液，并采用质粒小量提取试剂盒提取质粒，同时提取质粒、双酶切以及500ul菌液进行测序验证；
[0021]优选的，所述S6中，测序验证完成后由专业人员通过测序验证结果进行处理构建PCR检测载体，其中测序结果显示错误则停止PCR检测载体构建，同时由专业人员重新进行载体选择，并重新设计特异性引物，测序结果显示正确则对提取的质粒进行双酶切回收目的片段，对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段，并将目的片段与表达载体的大片段用T4DNA连接酶连接后转化为DH5a，并涂板，在温度条件为37℃恒温条件下过夜，其中过夜后由专业人员挑取阳性克隆大摇酶切验证，并通过验证结果进行判断，其中验证结果显示结果正确则判断为载体构建完毕，验证结果显示结果错误则判断为载体构建未完成，且判断结果为载体构建完毕则不进行处理，判断结果为载体构建未完成则由专业人员重新进行载体选择，并重新设计特异性引物；
[0022]优选的，所述S7中，由专业人员对所述构建的PCR检测载体进行使用，其中通过专业人员将所述构建的的PCR检测载体对使用对象进行使用，并记录使用得出的诊断结果与结果诊断周期，同时通过专业检测机构对使用对象进行特定载体检测，并由专业人员记录检测结果与诊断周期，使用完成后由专业人员将获取的诊断结果与结果诊断周期进行对比，通过对比计算出所述构建的PCR检测载体检测正确率，并由专业人员通过计算结果与获取的数据本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR检测载体，其特征在于，包括以下重量份的原料：载体5
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15份、特异性引物10
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30份、高保真酶7
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18份、小鼠光感受器细胞cDNA 12
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22份、1％琼脂糖凝胶13
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47份、连接产物10
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25份、DH5a感受态细菌20
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27份。2.一种PCR检测载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：载体选择：由专业人员进行载体选择，并通过选定的目的基因，设计特异性引物；S2：PCR扩增：特异性引物设计完成后由专业人员利用高保真酶进行PCR扩增；S3：酶切反应：由专业人员对载体和目标片段进行限制性酶切反应；S4：连接转化：进行连接转化；S5：PCR验证：由专业人员挑取阳性克隆进行PCR验证；S6：构建PCR检测载体：测序验证完成后由专业人员通过测序验证结果进行处理构建PCR检测载体；S7：进行使用：由专业人员对所述构建的PCR检测载体进行使用。3.根据权利要求2所述的一种PCR检测载体的构建方法，其特征在于，所述S1中，由专业人员进行载体选择，其中进行载体选择时由专业人员根据所要构建的PCR检测载体的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体，并通过选定的目的基因，设计特异性引物，其中进行引物设计时基因序列为Nrf2则特异性引物为Nrf2pC1EcoR
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F为CGGAATTCCGCCACCATGATGGACTTGGAGTTGCCACC以及Nrf2pC1BamH
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R为CGGGATCCCTAGTTTTTCTTTGTATCTGGCTTCTTGC。4.根据权利要求2所述的一种PCR检测载体的构建方法，其特征在于，所述S2中，特异性引物设计完成后由专业人员利用高保真酶进行PCR扩增，其中进行PCR扩增时以小鼠光感受器细胞cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，并在引物两端分别引入EcoRI和BamHI的酶切位点，同时通过1％琼脂糖凝胶回收目的基因DNA条带。5.根据权利要求2所述的一种PCR检测载体的构建方法，其特征在于，所述S3中，由专业人员对载体和目标片段进行限制性酶切反应，其中进行限制性酶切反应时质粒载体Plvx
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DsRed
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monomer
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C1和目的基因PCR产物的EcoRI和BamHI双酶切，且所述酶切反应的反应条件为在37℃水浴反应2h，其中所述酶切反应完成后通过1％琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒Plvx
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DsRed
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monomer
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C1酶切大片段和目的基因酶切片段。6.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张炜煜，王岙，
申请(专利权)人：吉林省疾病预防控制中心吉林省公共卫生研究院，
类型：发明
国别省市：