优化的蛋白融合和接头制造技术

本发明专利技术涉及用于产生多功能嵌合蛋白的优化的蛋白融合接头及其使用方法。此外，本发明专利技术涉及用于引导的核酸内切酶系统的嵌合蛋白。涉及用于引导的核酸内切酶系统的嵌合蛋白。涉及用于引导的核酸内切酶系统的嵌合蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优化的蛋白融合和接头
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年4月20日提交的专利技术名称为“优化的蛋白融合和接头”的美国临时专利申请序列号63/012658的根据35U.S.C.119的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。


[0003]本专利技术涉及嵌合蛋白及其在活细胞中的使用方法。
[0004]序列表
[0005]本申请包含已经通过EFS
‑
Web以ASCII格式提交的序列表，其通过引用整体并入本文。该ASCII副本，创建于____，名称为____，大小为____字节。

[0006][0007]本专利技术涉及用于产生多功能嵌合蛋白的优化的蛋白融合接头及其使用方法。此外，本专利技术涉及用于引导的核酸内切酶系统的嵌合蛋白。

技术介绍

[0008]出于许多原因，引导的核酸内切酶与一种或多种不相关的酶的融合是合乎需要的。在某些情况下，观察和监测引导的核酸内切酶试剂向靶细胞核或核仁的成功递送是有用的。在其他情况下，在引导的核酸内切酶切割后，融合DNA修饰酶以影响特定的修复结果可能是有用的。
[0009]重组融合蛋白的构建需要选择合适的接头来连接蛋白结构域。没有接头的功能域的直接融合可能导致许多问题，包括融合蛋白的错误折叠、蛋白产量低或生物活性受损。例如，使用与荧光蛋白融合的工程核酸酶的一个障碍是，这种融合往往具有较低的编辑活性，这可能是由于两种蛋白的非天然融合引起的空间干扰。
[0010]实现融合蛋白的高功能活性可能取决于亚基之间接头的性质，因为蛋白的直接融合可能会抑制折叠、稳定性和生物活性。此外，连接的结构域会干扰彼此的功能，物理分离这些结构域可以改善功能。结构域之间的接头的性质可以影响平均分离距离，这取决于接头的刚性和长度。
[0011]接头通常分为三类：柔性的、刚性的和可切割的。柔性接头通常由甘氨酸重复序列组成，定期添加极性丝氨酸残基以破坏接头蛋白的相互作用。刚性接头包括形成α螺旋结构的A(EAAAK)
n
A重复序列或形成相对刚性的延伸棒状结构的富含Pro的序列(XP)
n
。
[0012]因此，需要克服现有技术存在的挑战的方法和组合物。在引导的核酸内切酶酶融合中特别优化的一组通用肽接头的新方法和组合物对于改进引导的核酸内切酶以及共价融合的蛋白伴侣的功能来说是合乎需要的。

技术实现思路

[0013]总的来说，本专利技术涉及用于改进的多功能嵌合蛋白和改进的接头的方法和组合物。在一些实施方案中，嵌合蛋白包含引导的核酸内切酶蛋白，例如RNA引导的核酸内切酶(“RGEN”)，包括Cas/CRISPR蛋白，其通过一组通用肽接头与伴侣蛋白共价融合。在另外的实施方案中，融合蛋白包含刚性接头系统以融合两种蛋白。在进一步的实施方案中，刚性接头可用于包含融合到荧光蛋白的Cas蛋白的融合蛋白。
[0014]出于许多原因，引导的核酸内切酶的Cas蛋白与一个或多个不相关的蛋白伴侣的融合是合乎需要的。例如，一个实施方案包括产生CRISPR/Cas9蛋白融合以在活细胞中的精确位置切割双链DNA的能力。Cas9是RNA引导的核酸内切酶，其来自化脓性链球菌(Steptococcus pyogenes)的成簇规则间隔短回文重复序列((CRISPR)
‑
Cas(CRISPR相关的))细菌适应性免疫系统。Cas9被靶位点特异性20
‑
nt互补RNA(44
‑
nt crRNA的一部分)和通用89
‑
nt tracrRNA(统称为引导RNA(gRNA)复合物)引导至23
‑
nt DNA靶序列。Cas9
‑
gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物介导双链DNA断裂(DSB)，然后通过非同源末端连接(NHEJ)修复，如果存在合适的模板核酸，通常在切割位点引入突变或缺失，这经常通过移码突变或同源定向修复(HDR)系统频繁导致基因破坏。
[0015]在一个实施方案中，已针对CRISPR酶融合而特别优化的一组通用肽接头对于改进Cas9和共价融合的伴侣蛋白或蛋白结构域的功能来说是合乎需要的。通用接头不会特异于Cas9蛋白或其任何突变变体。在另一实施方案中，CRISPR酶可以用通用接头与荧光蛋白最佳连接。
[0016]在一个实施方案中，刚性接头用于共价融合两种不同的蛋白或蛋白结构域。在一个方面，使用刚性接头，其包括形成α螺旋结构以提供刚性的A(EAAAK)
n
A重复序列。在另一方面，使用形成相对刚性的延伸棒状结构的(XP)
n
重复序列。
[0017]在第一方面，提供了嵌合蛋白。嵌合蛋白包括引导的核酸内切酶蛋白、刚性接头和第二蛋白。
[0018]在第二方面，提供了富集具有嵌合蛋白的细胞的方法。该方法包括几个步骤。第一步包括将根据第一方面的嵌合蛋白与引导RNA一起孵育以形成RNP复合物。第二步包括将RNP复合物与多个靶细胞接触，以产生具有RNP复合物的受体细胞。第三步包括基于荧光信号分选受体细胞。
[0019]在第三方面，提供了编码嵌合蛋白的分离核酸。嵌合蛋白包括第一方面的嵌合蛋白。
[0020]在第四方面，提供了嵌合蛋白。嵌合蛋白包括引导的核酸内切酶蛋白、通用接头和第二蛋白。
[0021]在第五方面，提供了分离核酸。分离核酸编码根据第四方面的任一方面的嵌合蛋白。
[0022]在第六方面，提供了富集具有嵌合蛋白的细胞的方法。该方法包括几个步骤。第一步包括将根据第四方面的任一方面的嵌合蛋白与引导RNA一起孵育以形成RNP复合物。第二步包括将RNP复合物与多个靶细胞接触，以产生具有RNP复合物的受体细胞。第三步包括基于荧光信号分选受体细胞。
附图说明
[0023]图1A描绘了与作为质粒(400ng)递送的未标记的Cas9蛋白(表示为“C”(SEQ ID NO:1))相比，Cas9
‑
eGFP接头变体(L1，Cas9
‑
GSAGSAAGSGEF
‑
eGFP(SEQ ID NO:38)；L2，Cas9
‑
(AP)7A
‑
eGFP(SEQ ID NO:49)；L3，Cas9
‑
A(EAA AK)4A
‑
eGFP(SEQ ID NO:40)；L4，Cas9
‑
GGGGSEAAAKGGGG
‑
eGFP(SEQ ID NO:71)和L5，Cas9
‑
(GGGGS)4A
‑
eGFP(SEQ ID NO:39))的切割核酸内切酶活性百分比，其中在质粒递送后24小时通过反向转染递送sgRNA引导靶向HPRT
‑
38087(SEQ ID NO:324)。48小时后的编辑活性通过T7E1测定法来测量。
[0024]图1B描绘了与作为质粒(4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合蛋白，其包含引导的核酸内切酶蛋白、刚性接头和第二蛋白。2.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述引导的核酸内切酶蛋白是Cas蛋白。3.根据权利要求2所述的嵌合蛋白，其中所述Cas蛋白选自由Cas9蛋白、AsCas12a蛋白、LbCas12a蛋白、Cas9蛋白变体、AsCas12a蛋白变体和LbCas12a蛋白变体组成的组。4.根据权利要求2所述的嵌合蛋白，其中所述Cas蛋白选自包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的组。5.根据权利要求2所述的嵌合蛋白，其中所述Cas蛋白是SEQ ID NO:1。6.根据权利要求2所述的嵌合蛋白，其中所述Cas蛋白是SEQ ID NO:2。7.根据权利要求2所述的嵌合蛋白，其中所述Cas蛋白是SEQ ID NO:3。8.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中第二蛋白是荧光蛋白。9.根据权利要求8所述的嵌合蛋白，其中所述荧光蛋白选自包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的组。10.根据权利要求8所述的嵌合蛋白，其中所述荧光蛋白是SEQ ID NO:4。11.根据权利要求8所述的嵌合蛋白，其中所述荧光蛋白是SEQ ID NO:5。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述刚性接头选自包含XP、APA、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11
‑
23和SEQ ID NO:24
‑
36的组。13.根据权利要求12所述的嵌合蛋白，其中所述刚性接头是SEQ ID NO:8。14.根据权利要求12所述的嵌合蛋白，其中所述刚性接头选自包含XP和SEQ ID NO:24
‑
36的组。15.根据权利要求12所述的嵌合蛋白，其中所述刚性接头选自SEQ ID NO:29
‑
31。16.根据权利要求12所述的嵌合蛋白，其中所述刚性接头选自包含APA和SEQ ID NO:11
‑
23的组。17.根据权利要求12所述的嵌合蛋白，其中所述刚性接头选自包含APA和SEQ ID NO:17
‑
18的组。18.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其包含选自由SEQ ID NO:40
‑
70、SEQ ID NO:74
‑
104、SEQ ID NO:108
‑
138、SEQ ID NO:142
‑
172、SEQ ID NO:176
‑
206、SEQ ID NO:210
‑
240、SEQ ID NO:244
‑
274和SEQ ID NO:278
‑
308组成的组中的成员。19.一种富集具有嵌合蛋白的细胞的方法，包括：a)将根据权利要求1所述的嵌合蛋白与引导RNA一起孵育以形成RNP复合物；b)将RNP复合物与多个靶细胞接触，以产生具有RNP复合物的受体细胞；和c)基于荧光信号分选受体细胞。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述嵌合蛋白包含选自由SEQ ID NO:40
‑
70、SEQ ID NO:74
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104、SEQ ID NO:108
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138、SEQ ID NO:142
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172、SEQ ID NO:176
‑
206、SEQ ID NO:210
‑
240、SEQ ID NO:244
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274和SEQ ID NO:278
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308组成的组中的成员。21.一种分离核酸，其中所述分离核酸编码根据权利要求1所述的嵌合蛋白。22.根据权利要求21所述的分离核酸，其中所述嵌合蛋白包含选自由SEQ ID NO:40
‑
7...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：综合DNA技术公司，
类型：发明
国别省市：