本发明专利技术涉及一种预测动物组织铁死亡敏感性的方法，包括：将动物组织样品用脂质过氧化传感器进行染色；利用脉冲激光照射动物组织样品中的待测区域；采集待测区域中脂质过氧化传感器的氧化态荧光信号；根据氧化态荧光信号预测动物组织对铁死亡敏感性。本发明专利技术的方法可以快速预测肿瘤组织对铁死亡诱导剂的响应能力，从而可以应用于利用动物组织尤其是肿瘤组织对铁死亡敏感性来进行抗癌药物开发的领域。对铁死亡敏感性来进行抗癌药物开发的领域。
【技术实现步骤摘要】
一种预测动物组织对铁死亡敏感性的方法
[0001]本专利技术涉及铁死亡敏感性检测
，具体涉及一种快速预测动物组织，尤其是肿瘤组织对铁死亡敏感性的方法。
技术介绍
[0002]铁死亡是一种由细胞膜内多不饱和磷脂的异常过氧化引起的非凋亡性细胞死亡程序，其主要机制是，在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡。
[0003]近期研究发现细胞发生铁死亡参与人体多种疾病与组织损伤过程，包括缺血/再灌注诱导的肝、肾、心、脑损伤等急性器官损伤和神经退行性病变等。另一方面，有研究表明，多种恶性肿瘤细胞对铁死亡高度敏感，包括肾癌和卵巢癌的透明细胞癌、胰腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、结直肠癌和已获得耐药性的癌细胞。因此，诱导人类肿瘤细胞的多不饱和脂质过氧化和铁死亡是一种有前景的癌症治疗策略。
[0004]靶向铁死亡通路的咪唑酮及重组半胱氨酸酶等药物已表现出肿瘤抑制作用，或直接调节多不饱和脂肪酸水平也表现出良好的抑制肿瘤生长的疗效。然而，目前仍然缺乏经过临床验证的可以指示体内铁死亡敏感性的生物标志物，也没有特定的基因型及原发肿瘤谱系可以预测铁死亡的反应性。快速鉴别铁死亡诱导剂对癌症患者是否有潜在治疗效果仍然是开发铁死亡靶向药物的主要挑战。
[0005]因此，亟需一种快速筛查和无创评估患者细胞组织对铁死亡敏感性的技术，实现铁死亡药物的个体化高效治疗。
技术实现思路
[0006]针对上述问题，本专利技术一个目的是提供一种快速预测动物组织对铁死亡敏感性的方法，所述方法利用高功率脉冲激光诱导生物膜上局部脂质过氧化，通过脂质过氧化传感器捕获并检测荧光强度，由此可以预测动物组织对铁死亡敏感性。本专利技术的方法可以快速预测肿瘤组织对铁死亡诱导剂的响应能力，从而可以应用于利用动物组织尤其是肿瘤组织对铁死亡敏感性来进行抗癌药物开发的领域。
[0007]根据本专利技术，提供了一种预测动物组织对铁死亡敏感性的方法，包括：
[0008](1)将动物组织样品用脂质过氧化传感器进行染色；
[0009](2)利用脉冲激光照射动物组织样品中的待测区域；
[0010](3)采集待测区域中脂质过氧化传感器的氧化态荧光信号；
[0011](4)根据氧化态荧光信号预测动物组织对铁死亡敏感性。
[0012]在上述步骤(1)中，所述动物组织可以是动物体内的任何组织，例如大脑、肝脏、心脏、肾脏、肌肉、脾脏、淋巴、甲状腺、前列腺、膀胱、卵巢等，也可以是肿瘤组织，例如各种实体瘤、移植瘤等，但不限于此。
[0013]所述动物组织样品可以是上述组织的整体或其一部分，特别是切片。
[0014]所述动物可以是脊椎动物，包括哺乳动物、爬行动物、鸟等，但不限于此。所述哺乳动物例如可以是人、鼠、兔、猪、牛、羊、马、猴等，但不限于此。
[0015]在上述步骤(1)中，脂质过氧化传感器是用于检测脂质的过氧化水平的荧光探针，其通常情况下处于还原态，一般发射红色荧光，与过氧自由基反应后转变为氧化态，荧光发生变化，发射绿色荧光。因此，脂质过氧化传感器氧化态发射的绿色荧光强度与脂质的过氧化水平正相关。由于动物组织脂质发生过氧化的难易程度与组织的铁死亡敏感性正相关，因此通过诱导组织脂质的过氧化并采用脂质过氧化传感器检测脂质的过氧化水平，则脂质过氧化传感器的氧化态荧光强度就与铁死亡敏感性正相关，由此可以根据脂质过氧化传感器的氧化态荧光强度预测动物组织对铁死亡敏感性。
[0016]术语“脂质过氧化传感器”也可以称为“脂质过氧化荧光探针”，其通常为一种染料，能够用于指示脂质过氧化和抗氧化性能，但本专利技术不限于此。
[0017]脂质过氧化传感器例如可以是BODIPY
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C11(以下有时简称为B
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C11)，BODIPY 665/676等，但不限于此。
[0018]BODIPY
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C11也可以称为C11
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BODIPY581/591，BODIPY 581/591等，其结构如下，是脂质过氧化(lipid peroxidation)的荧光比值探针，常用于评价模型膜系统和活细胞中的脂质过氧化和抗氧化作用。
[0019][0020]将动物组织样品用脂质过氧化传感器进行染色可以通过将动物组织样品(例如切片)浸没在脂质过氧化传感器溶液(一般在血清或PBS缓冲液中稀释)中进行。在染色过程中，脂质过氧化传感器由于其亲酯性而与动物组织样品中的脂质结合。脂质过氧化传感器溶液的用量根据组织样品的大小而定。例如，在切片厚度为8μm～20μm，面积为0.5cm2，脂质过氧化传感器采用BODIPY
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C11，溶液浓度为5μM时，采用100μl的用量(具体用量可通过切片面积大小同比例增减)。但是本专利技术不限于此。
[0021]动物组织样品浸没在脂质过氧化传感器溶液中的时间没有特别限定，只要能够脂质过氧化传感器能够充分渗透即可，可以由本领域技术人员根据组织样品的大小、厚度、温度、浓度等参数通过简单实验而确定，例如可以为10分钟以上，20分钟以上，约30分钟等。但不限于此。
[0022]在步骤(2)中，利用高功率激光脉冲诱导动物组织膜上局部脂质过氧化。脂质过氧化产生过氧自由基，进而与脂质过氧化传感器反应使脂质过氧化传感器由还原态(发射红色荧光)转变为氧化态(发射绿色荧光)。由此，动物组织膜上局部脂质的过氧化程度可通过脂质过氧化传感器的荧光信号捕获，脂质过氧化传感器氧化态的荧光强度与脂质的过氧化水平正相关。动物组织脂质发生过氧化的难易程度与组织的铁死亡敏感性正相关，从而氧化态的荧光信号依赖于动物组织的铁死亡敏感性，因此通过刺激(即脉冲激光照射动物组织样品中的待测区域)后氧化态荧光信号可以评估铁死亡敏感程度。
[0023]在步骤(2)中，“脉冲激光”可以是波长在近紫外光区(例如405nm)的单光子激光，也可以来自波长在近红外光区(例如800nm)的双光子激光。但不限于此。
[0024]在步骤(2)中，动物组织样品中的待测区域的面积没有特别限制，可以根据需要而选择。例如，待测区域的面积可以为2
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4μm2。例如可以根据激光的照射面积选择，也可以根据待测区域的面积调节激光的照射面积。
[0025]在步骤(2)中，利用脉冲激光照射动物组织样品中的待测区域时，可以给予至少一次脉冲，例如1至20次，或1至10次，或2至8次，例如3、4、5、6、7次。
[0026]在给予脉冲时，每次脉冲激光照射的曝光时间没有限制，只需488nm绿色荧光强度适中且没有过度曝光即可。本领域技术人员可以根据所采用的脂质过氧化传感器通过简单实验确定适合的曝光时间。此外，本领域技术人员可以根据曝光量调整光源强度以及检测器电压，来得到稳定且强度适中的荧光信号。例如在采用BODIPY
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C11作为脂质过氧化传感器时，曝光时间可以为50至2000毫秒，或者50至1000毫秒，例如60本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种预测动物组织对铁死亡敏感性的方法，包括：(1)将动物组织样品用脂质过氧化传感器进行染色；(2)利用脉冲激光照射动物组织样品中的待测区域；(3)采集待测区域中脂质过氧化传感器的氧化态荧光信号；(4)根据氧化态荧光信号预测动物组织对铁死亡敏感性。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述脂质过氧化传感器为BODIPY
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C11或BODIPY 665/676。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)中，脉冲激光是波长在近紫外光区的单光子激光，或波长在近红外光区的双光子激光。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(3)中，采用显微镜成像的方法采集脂质过氧化传感器的氧化态荧光信号。5.根据权利要求4所述的方法，其中，通过显微镜成像来采集脂质过氧化传感器的氧化态的荧光信号，然后通过统计待测区域内的灰度值来反映荧光信号的强度。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述方法采用共聚焦显微镜进行，所述方法包括：(1)将动物组织样品用脂质过氧化传感器进行染色；(2)利用共聚焦显微镜的脉冲激光照射动物组织样品中的待测区域；(3)通过显微镜成像采集待测区域中脂质过氧化传感器的氧化态荧光信号，通过统计待测区域内的灰度值来反映荧光信号的强度；(4)根据氧化态荧光信号的强度预测动物组织对铁死亡敏感性。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述共聚焦显微镜为激光扫描共聚焦显微镜或者双光子共聚焦显微镜。8.根据权利要求4
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7中任一项所述的方法，其中，采用BODIPY
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C11作为脂质过氧化传感器，在选自460nm至520nm的一个波长处采集脂质过氧化传感器的氧化态荧光信号。9.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)和(2)之间还包括采集激光照射前还原态的荧光信号的步骤。10.根据权利要求9所述的方法，其中，根据氧化态荧光信号预测动物组织对铁死亡敏感性如下进行：按照...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹贻龙，王凤翔，石振楠，王煜棋，纳斯查尔，
申请(专利权)人：西湖实验室生命科学和生物医学浙江省实验室，
类型：发明
国别省市：
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