一种提取并分离猕猴外周血单个核细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种提取并分离猕猴外周血单个核细胞的方法，主要涉及细胞技术领域，通过对常规的PBMC提取法进行针对猕猴的特异性优化，调整了其流程操作方法及过程中所使用的仪器试剂包括但不限于离心管，吸弃转移操作，抗凝处理及配方，实验环境要求等。力求最大程度的移除这一长耗时且复杂的流程操作中人工干涉带来的影响及快速得到更高的细胞得率和提纯后的存活率。提纯后的存活率。提纯后的存活率。

【技术实现步骤摘要】
一种提取并分离猕猴外周血单个核细胞的方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学和免疫学领域，涉及一种提取并分离猕猴外周血单个核细胞的方法，具体涉及到一种猕猴外周全血中的PBMC细胞提纯分离，属于生物化学领域中检测类技术的常用范畴。

技术介绍

[0002]外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞（Monocyte）。PBMC主要包括两大类：淋巴细胞和单核细胞，是免疫系统的重要组成部分，在特异性免疫和非特异性免疫中都发挥着重大作用。外周血单个核细胞(PBMC)是细胞免疫学研究中最常见的细胞模型。将类人属的动物用作实验动物模型以获得PBMC并进行体外研究，这在人类免疫性疾病的发病机制和治疗中具有重要的现实意义。
[0003]通常生物研究中如果检测红细胞或者血小板，则需要用全血；如果检测的是粒细胞，则直接裂解红细胞即可；而如果检测的是淋巴细胞或者单核细胞，那就需要用PBMC。因为全血中红细胞和血小板加起来要占99%以上，这些细胞的存在对于抗体标记和流式分析都会产生很大的影响，很可能因此得到错误的结果。如果检测的是淋巴细胞或者单核细胞，直接使用全血测，得到的结果往往是不被当下的论文审阅规章所认可的。
[0004]猕猴（rhesus monkey, macaca mulatta zimmermann）属于哺乳纲，灵长目，猴科，猕猴属动物。猕猴作为灵长类动物，在组织结构、生理、代谢机能等方面同人类极为相似，是人类的近属动物，故它是一种极为珍贵的实验动物。用此类动物进行实验，最易解决人类的病害，研究出其发病机制。一般应用于寄生虫病、生殖生理、药理学、毒理学、口腔医学、细菌性疾病、营养代谢、内分泌学等的研究。
[0005]PBMC分离技术为免疫系统研究的一个基本的实验技术，然而相关的配套流程手法包括从活体上采集全血，抗凝保存处理，以及后续的血浆分离和提纯细胞并完成计数及切片都还不够完善和具有针对性，往往会带来结果中的红细胞残余过剩，而单个核细胞纯度过低并导致活性大失。而专门应用于实验动物模型的手法应该和应用于人体采样样本之间有很大的区别，由于物种差异性导致的结果数据缺失，往往需要事倍功半的进行弥补，增大了消耗和工作量却拖慢了研究进程，鉴于考虑到实验伦理等因素。因此本专利技术旨在提供一种经测试后，优于非特异性的采取外周全血及后续分离PBMC的对猕猴流程方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的在于提供一种提取并分离猕猴外周血单个核细胞的方法，其特征在于包含如下步骤：（1）从实验动物体内采集全血，将得到的血样以1000g离心10min；（2）将血样进行抗凝处理，并添加一定量的HBSS；（3）将抗凝处理后的血样放入高速低温离心机在4
‑
10
°
C下2200rpm或1000g离心
10min；（4）将处理后的全血样本放入50ml大容量离心管Accuspin预填充HISTOPAQUE密度梯度分离液在下部分层，放入高速离心机以升速9降速1下1000
‑
1200g离心25min；（5）将离心后得到的含有血浆、红细胞、单个核细胞的多细胞分层，进行吸弃上清，此时上清处于最上层，占据最大体积；（6）将剩下的第二层白色薄层PBMC轻轻吸取并转移到普通离心管中，加入足量的dPBS直至50ml，再次进行与上述同速的高速离心15
‑
20min；（7）将离心完成的浑浊悬浮液样本利用抽真空的形式进行吸弃上清，缓速吸弃至底部时，应看见淡淡红色沉淀位于离心管底部，小心保留；（8）可酌情重复一次或多次的步骤（6）（7）离心吸弃操作进行进一步的提纯，通常视血样质量而定；最后，（9）将得到的沉淀用适量dPBS溶解后，吸取并添加进预备好的含有DMSO的培养液中，并根据定量分别存入1.5ml冻存管中，置于冻存盒密闭储藏于
‑
80
°
C冰箱，并于第二天转入液氮中长期保存。
[0007]优选地，所述步骤（2）中的抗凝处理，所添加的抗凝剂为GDTA二钠，EDTA，双草酸盐，枸橼酸钠中的一种或几种，抗凝剂使用的量为每100ml血样添加1
‑
5mg的质量体积；优选地，所述步骤（4）中的大容量离心管为专门选定的Accuspin聚丙烯管，下半隔层中预填充HISTOPAQUE分离液；优选地，所述步骤中提及的吸弃上清皆为使用橡皮管连通真空抽气泵的塑料吸管而非大号可手动式电动移液枪；优选地，所述步骤中的流程操作均应在不高于22
°
C的室温实验环境下进行，通风橱内应保持通风洁净，并提前进行过消毒擦拭和紫外灯照射；优选地，所述的新鲜采集的血液样本完成抗凝处理的时间应控制在采集后2小时内，而分离PBMC的完成应控制在抗凝后6小时内。
[0008]本专利技术专项优化后的针对于猕猴的提取并提纯PBMC流程方法的创新及有益效果主要体现于：1. 使用的ACCUSPIN聚丙烯管经γ辐照灭菌处理，管内高密度的聚乙烯多孔隔层将其分为两室，下半部分可以自由选择预填充分离液等密度梯度介质，从而帮助将红细胞等大体积的成分沉淀在底并经由一层薄膜与上层隔开，确保了提纯结果的纯度，稳定性及可重复操作性能。同时在处理流程上大大节省了准备及后续的残留处置的时间，显著提升效率。同时在将血浆去除，PBMC分离提取出来后仍然在accuspin管底部分层中保留红细胞成分，不像一般的操作流程中因采血样品剩余部分混杂在一起而不得不全部遗弃，从而达到一次实验，同时可以保留2种侧重不同的结果。
[0009]2.使用真空泵抽气取代了大容量可手动式电动移液枪降低了对技术人员吸弃上清悬浮液时的操作要求，缩短了操作时间并显著提升流程效率，并且得到的PBMC纯度往往只会更高而不会降低。
[0010]3.整体流程方法的优化确保了吸弃及移液等的转移过程中不需要来回循环往复的操作步骤，避免移液过程可能出现的交叉污染，亦或是复杂步骤中导致的样本及容器混淆，避免了这一通常长达4小时以上的流程操作中人工干预的主观因素带来的影响，诸如污
其中应分别为活性细胞及失活细胞计数，细胞活力（%）=分离后活细胞数/分离后总细胞数（包含死去的）得出数据如表1所示：从上表1可以看出，对于同源猕猴血样所采用的常规通用PBMC提纯试剂盒所得到的细胞存提取个数与存活率较本专利技术所优化的猕猴特异化PBMC提纯分离处理流程方法有显著差异。而常规分离PBMC的细胞总数与本专利技术采用的方法所得的细胞计数相差不大，但是细胞存活率显著降低。而考虑到PBMC作为一个精细且复杂的长线操作流程中人工干涉带来的条件影响，合理的怀疑结果1所用处理时间过长，与其细胞得率存活率最低也是有相关联的；反之，其他操作流程时间更加合理的结果所得都处于可接受的误差范围之内。这表明通过优化提纯分离流程操作中的具体试剂仪器等实验条件，能够达到更好的针对分离猕猴PBMC的效果，获得更高的细胞活率的PBMC。
[0015]以上所述仅为本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取并分离猕猴外周血单个核细胞的方法，其特征在于包含如下步骤：（1）从实验动物体内采集全血，将得到的血样以1000g离心10min；（2）将血样进行抗凝处理，并添加HBSS；（3）将抗凝处理后的血样放入高速低温离心机在4
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10℃下2200rpm或1000g离心10min；（4）将处理后的全血样本放入50ml大容量离心管Accuspin预填充HISTOPAQUE密度梯度分离液在下部分层，放入高速离心机以升速9降速1下1000
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1200g离心25min；（5）将离心后得到的含有血浆、红细胞、单个核细胞的多细胞分层，进行吸弃上清，此时上清处于最上层，占据最大体积；（6）将剩下的第二层白色薄层PBMC轻轻吸取并转移到普通离心管中，加入足量的dPBS直至50ml，再次进行与上述同速的高速离心15
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20min；（7）将离心完成的浑浊悬浮液样本利用抽真空的形式进行吸弃上清，缓速吸弃至底部时，应看见淡淡红色沉淀位于离心管底部，小心保留；（8）可酌情重复一次或多次的步骤（6）（7）离心吸弃操作进行进一步的提纯，通常视血样质量而定；最后，（9）将得到的沉淀用适量dPBS溶解后，吸取并添加进预备好的含有DMSO的培养液中，并根据定量分别存入1...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，刘泽熙，彭家伟，刘振宇，李雪玲，王丹，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：