将外源基因转化到荷花中进行稳定表达的方法技术

一种将外源基因转化到荷花中进行稳定表达的方法，其特征在于，通过制备含有外源基因的农杆菌菌液并将其施加至成熟时期的荷花雌蕊上，通过人工授粉的方式获得荷花种子，实现稳定表达。本发明专利技术在受体植物原位进行，避开了荷花组织培养和离体再生过程困难的问题，操作简便，转化效率可达12.5％～40.5％，得到的转基因种子成苗率高，此发明专利技术方法为荷花的分子育种、遗传改良和分子生物学的研究提供了广阔的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
将外源基因转化到荷花中进行稳定表达的方法


[0001]本专利技术涉及的是一种基因工程领域的技术，具体是一种将外源基因转化到荷花中进行稳定表达的方法。

技术介绍

[0002]荷花是多年生水生草本植物，为印度国花及世界著名宗教圣花，在我国分布极为广泛，栽培历史悠久，是中国传统十大名花之一，具有极高的文化内涵及观赏价值。荷花不仅文化底蕴深厚，且具有极高的经济价值。莲藕是我国重要的蔬菜之一，莲子、莲子胚芽、莲藕、藕节、荷叶及荷花等都可入药。荷花作为著名的观赏植物，可以用作盆花或切花，不仅能美化环境，还可以净化水体，荷花是集观赏、食用、药用及文化于一体的非常重要的花卉。因此，急需加大荷花新品种选育及创新工作的进度，从而提供良好的经济效益和社会效益。
[0003]尽管荷花的全基因组测序已经完成，但荷花的分子育种和分子生物学方面的研究依然远远落后于模式植物，也落后于其它一些重要观赏花卉。主要原因是荷花的遗传转化体系和外植体再生一直是难点，迄今为止鲜有成功报道，导致荷花的转基因研究进展十分缓慢。现有技术很难实现外源基因整合到基因组中稳定表达。因此，为了有效地进行荷花功能基因的开发，进行有目的的分子定向育种，需要建立荷花的稳定的转基因表达体系。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提出一种将外源基因转化到荷花中进行稳定表达的方法，操作方法简便，避开了荷花组织培养和离体再生过程困难的问题，转化率达12.5％～40.5％，得到的转基因种子成苗率高，可用于进行荷花功能基因的验证和应用。r/>[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]本专利技术涉及一种将外源基因转化到荷花中进行稳定表达的方法，通过制备含有外源基因的农杆菌菌液并将其施加至成熟时期的荷花雌蕊上，通过人工授粉的方式获得荷花种子，实现稳定表达。
[0007]所述方法具体包括以下步骤：
[0008]步骤1)含有外源基因的农杆菌的制备：
[0009]1.1)将含有外源基因的质粒pCAMBIA1301
‑
GUS转入农杆菌中，挑取单克隆，PCR电泳检测获得阳性农杆菌备用；
[0010]1.2)挑取单克隆阳性农杆菌转入YEB液体培养基中，过夜摇动培养16～20小时，使OD
600
达到0.5～0.8左右，然后将农杆菌转移到喷雾器小瓶中。
[0011]所述的含有外源基因的质粒，采用市售的pCAMBIA1301
‑
GUS。
[0012]所述的农杆菌采用：为GV3101或LBA4404菌株，菌株购自上海唯地生物技术有限公司。
[0013]步骤2)外源基因对荷花品种的转化：
[0014]2.1)选择荷花雌蕊成熟时期的花朵，将喷雾器对准花托雌蕊柱头位置喷射2～3
次；
[0015]2.2)通过人工授粉的方式将成熟花药的花粉抖落在柱头上，将花瓣重新闭合，顶端用细线扎紧，防止花瓣打开，套上网袋，并做好标签标记。
[0016]所述的荷花雌蕊成熟时期的花朵，优选为雌蕊柱头成熟时期的荷花，肉眼可见柱头带有粘性分泌物，一般为开花第一天或第二天未授粉的花朵。授粉的时间，一般选择6～8月份的05:00～08:00进行。
[0017]所述的人工授粉，优选在6～8月份的05:00～08:00进行；人工授粉使用的荷花成熟花粉，可以是来源于同一品种不同花朵的成熟花药，也可以来自不同品种的成熟花药。
[0018]步骤3)种子采收：48小时后，去除网袋，解开细线。待30～45天左右，种子成熟后收集种子。
[0019]步骤4)转基因种子的鉴定：种子用清水浸泡，让其自然萌发，待叶片长出后进行转基因鉴定。
[0020]所述的荷花采用但不限于美洲莲和亚洲莲不同品种的荷花。技术效果
[0021]与现有技术相比，本专利技术可以有效的进行荷花稳定的遗传转化实验，从而避开了荷花组织培养和外植体再生困难的历史难题，可以有效地进行荷花功能基因的开发，进行有目的的分子定向育种和荷花分子生物学的基础研究，市场应用潜力巨大。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例1中农杆菌喷洒成熟柱头的示意图；
[0023]图2为本专利技术实施例1中人工授粉示意图示意图；
[0024]图3为本专利技术实施例1中授粉后荷花花瓣重新闭合示意图；
[0025]图4为本专利技术实施例1中转基因种子的萌发和培养示意图；
[0026]图5为本专利技术实施例1中部分GUS转基因苗的鉴定结果示意图；
[0027]图6为本专利技术实施例1中部分转基因苗的盆栽示意图；
[0028]图7为本专利技术实施例1中转基因苗根状茎的GUS染色结果示意图；
[0029]图8为本专利技术实施例1中非转基因苗根状茎的GUS染色结果。
具体实施方式
[0030]本实施例包括以下步骤：
[0031]步骤1)将pCAMBIA1301
‑
GUS质粒转入农杆菌GV3101中，挑取单克隆，PCR电泳检测获得阳性农杆菌备用。
[0032]带有外源基因的农杆菌菌液的制备：挑取单克隆阳性农杆菌转入YEB液体培养基中，过夜摇动培养16～20小时，使OD600达到0.6左右。然后将农杆菌转移到喷雾器小瓶中。
[0033]所述的YEB液体培养基每升含有：牛肉浸膏5g、酵母浸膏1g、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgSO4·
H2O0.5g，余量为水且pH为7.0。
[0034]步骤2)外源基因对亚洲莲品种
‘
建选17
’
的转化：选择开花第一天或第二天的花朵，将喷雾器对准花托雌蕊柱头位置喷射2～3次，然后将带有成熟花粉的花药抖落在柱头上，将花瓣重新闭合，顶端用细线扎紧，防止花瓣打开，套上网袋，并做好标签标记，如图3所
示。
[0035]步骤3)2天后，将网袋去除。待45天左右，种子成熟时，收集种子。
[0036]步骤4)种子用清水浸泡，让其自然萌发，带小叶长出后进行转基因鉴定，如图4和图5所示。
[0037]PCR实验条件。反应体系：20μL体系中，加入0.2μM引物，2
×
TagMIX5μL，模板DNA50ng，最后补水至20μL总体积。PCR扩增条件：95℃变性5min。95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸30s；共计35个循环。最后72℃延伸10min。GUS基因鉴定引物，即如Seq ID No.2所示的上游引物M13
‑
F：5
’‑
ACTGGCCGTCGTTTTACAAC
‑3’
和如Seq ID No.3所示的下游引物GUS
‑
R1：5
’‑
TGAATGCCCACAGGCCGTCG
‑3’
。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0038]通过本方法转化共收获40颗种子。对其中40颗种子进行萌发，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将外源基因转化到荷花中进行稳定表达的方法，其特征在于，通过制备含有外源基因的农杆菌菌液并将其施加至成熟时期的荷花雌蕊上，通过人工授粉的方式获得荷花种子，实现稳定表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的含有外源基因的农杆菌菌液，通过以下方式制备得到：将含有外源基因的质粒转入农杆菌中，挑取单克隆，PCR电泳检测获得阳性农杆菌；然后挑取单克隆阳性农杆菌转入YEB液体培养基中，过夜摇动培养16～20小时，使OD
600
达到0.5～1.0。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的成熟时期的荷花雌蕊，选择开花第一天或第二天的花朵。4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的施加是指：将喷雾...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大生，田代科，刘凤栾，刘青青，陈青，
申请(专利权)人：上海辰山植物园，
类型：发明
国别省市：