编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的核酸及其用途制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的核酸及其用途。本发明专利技术对ND4的编码核酸序列进行了密码子优化，实验表明，采用本发明专利技术优化后序列制备获得的药物处理可以显著改善ND4突变导致的病人细胞的线粒体功能紊乱病变。细胞的线粒体功能紊乱病变。

【技术实现步骤摘要】
编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的核酸及其用途


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及编码NADH泛醌氧化还原酶4号 亚基的核酸及其用途。

技术介绍

[0002]ND4(NADH
‑
ubiquinone oxidoreductase chain 4，NADH泛醌氧化还原酶4 号亚基)是线粒体complex I(1号复合体)的核心亚基，它与其他六个亚基共 同构成了complex I的疏水区段。Complex I在线粒体呼吸链中扮演重要角色， 它能够氧化三羧酸循环和β
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氧化产生的NADH，还原泛醌，提供质子运输的 动力，从而帮助质子跨过线粒体内膜。线粒体DNA11778位点突变由线粒体 DNA(mtDNA)第11778位核苷酸发生突变引起的，此突变使呼吸链上ND4基因 编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸。虽然它们均为碱性氨基酸，但这 一位置的精氨酸是高度保守的。由于突变可能降低电子流动效率影响酶的活 性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生Leber 遗传性视神经病变LHON。
[0003]Leber遗传性视神经病变(LHON)是一种由线粒体基因组点突变引起的 母系遗传性疾病，全球发病率为1/30000。LHON患者的特征为：一般20
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30岁 发病，随着病程发展，患者的双侧视力急剧下降，直至最终失明。主要病因 是由于患者视网膜神经节细胞(RGCs)死亡，而RGC细胞的死亡要归因于患 者的线粒体基因突变。大多数与LHON相关的突变发生在complex I各亚基的编 码基因内，其中超过一半的突变发生于ND4的G11778A位点上。该突变占中国 LHON患者的89.2％，且预后最差。
[0004]目前传统的药物对治疗LHON患者作用有限，而AAV介导的基因治疗在 针对这类单基因突变的遗传疾病方面展现出巨大的潜力。但AAV介导的基因 治疗的效果依赖于基因序列，野生型AAV基因序列在以往的治疗中表现出的 疗效仍存在提高空间。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供编码NADH泛醌氧化还原 酶4号亚基(ND4)的核酸及其用途，以期提高ND4的表达水平，提高治疗 效果。
[0006]本专利技术提供了编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的核酸，包括I)～III) 中至少一种：
[0007]I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；
[0008]II)、与如I)所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的序列且编码如SEQID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；优选为具有至少80％同源性；更优选 为具有至少85％同源性；更优选为具有至少90％同源性；更优选为具有至少 95％同源性；更优选为具有至少96％同源性；更优选为具有至少97％同源性； 更优选为具有至少98％同源性；更优选为具有至少99％同源性。
[0009]III)、与I)或II)部分互补或完全互补的核酸。
[0010]本专利技术还提供了NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的转录单元，其包括： 启动子、本发
明所述的编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基(ND4)的核酸 和终止子。
[0011]本专利技术所述转录单元的5
’
端至3
’
端依次包括：
[0012]启动子、所述的编码核酸、调控片段A和终止子；
[0013]或启动子、所述的编码核酸、调控片段A、调控片段B和终止子。
[0014]本专利技术中，所述调控片段A和调控片段B选自COX10 UTR、SV40信号 片段。
[0015]本专利技术所述的重组载体，其包括骨架载体和本专利技术所述的核酸。
[0016]本专利技术所述的重组载体为病毒载体；所述病毒载体选自DNA病毒载体、 逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种； 其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或 AAV9。本专利技术所述重组载体的骨架载体为pAAV2。
[0017]一些实施例中，所述重组载体包括顺序连接的：AAV2 5
’
ITR、CMV增强 子、CMV启动子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的核 酸片段、标签片段、COX10 UTR、SV40信号片段、AAV2 3
’
ITR；
[0018]另一些实施例中，所述重组载体包括顺序连接的：AAV2 5
’
ITR、CMV增 强子、CMV启动子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的 核酸片段、标签片段、COX10 UTR、AAV2 3
’
ITR；
[0019]另一些实施例中，所述重组载体包括顺序连接的：AAV2 5
’
ITR、CMV增 强子、CMV启动子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的 核酸片段、标签片段、SV40信号片段、AAV2 3
’
ITR。
[0020]本专利技术所述的核酸、转录单元、所述的重组载体在制备防治线粒体功能 紊乱病变的药物中的应用。本专利技术所述的防治包括预防和/或治疗。本专利技术所 述防治线粒体功能紊乱病变为视神经病变；一些实施例中，所述视神经病变 为遗传性视神经病变。一些具体实施例中，本专利技术提供了所述的核酸、转录 单元、所述的重组载体在制备防治Leber遗传性视神经病变的药物中的应用。
[0021]本专利技术还提供了一种药物，其包括：本专利技术所述的核酸、转录单元或所 述的重组载体，还可以包括药学上可接受的载体和赋形剂。
[0022]本专利技术所述的药物中包括：所述重组载体、Lipofectamine 2000试剂和无 血清DMEM培养基。一些实施例中，所述重组载体的浓度为0.8μg/100μL～1.0 μg/100μL。
[0023]本专利技术还提供了一种药物的递送方法，其将本专利技术所述的药物制剂注射 至眼部，优选地为玻璃体腔注射。
[0024]本专利技术还提供了一种防治治疗Leber遗传性视神经病变的方法，其为给予 本专利技术所述的药物。所述给予的方式为玻璃体腔注射。
[0025]本专利技术对ND4的编码核酸序列进行了密码子优化，实验表明，采用本发 明优化后序列制备获得的药物处理可以显著改善ND4突变导致的病人细胞的 线粒体功能紊乱病变。用AAV2
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CMV
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ND4opt1药物处理293细胞，优化后 ND4可以在该细胞系中高效表达，且表达效率高于未优化的ND4序列。同时， 病人细胞经AAV2
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CMV
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ND4opt1药物处理后，恢复了在半乳糖培养基生长的 能力，产生ATP的能力得到了改善并接近野生型细胞，证明其线粒体功能紊 乱得到了修正。因此此AAV2
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CMV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的核酸，包括I)～III)中至少一种：I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；II)、与如I)所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列且编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；III)、与I)或II)完全互补的核酸。2.NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的转录单元，其包括：启动子、权利要求1所述的核酸和终止子。3.根据权利要求2所述的转录单元，其特征在于，其5
’
端至3
’
端依次包括：启动子、权利要求1所述的核酸、调控片段A和终止子；或启动子、权利要求1所述的核酸、调控片段A、调控片段B和终止子。4.重组载体，其包括骨架载体和权利要求1所述的核酸。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为病毒载体；所述病毒载体选自DNA病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9。6.根据权利要求4或5所述的重组载体，其特征在于，其骨架载体为pAAV2。7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，其包括顺序连接的：AAV2 5
’
ITR、CMV增强子、CMV启动子、Chimeric intro...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，肖溯，
申请(专利权)人：纽福斯苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：