一种浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱、检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱、检测试剂盒及应用，所述表达谱主要由上调表达的hsa

【技术实现步骤摘要】
一种浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱、检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱、检测试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，我国是食管癌的高发区。根据2020年全球癌症统计报告，食管癌的发生率和死亡率分别居所有36种恶性肿瘤的第7位和第6位。食管癌在组织学上分为食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EA)和食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)，我国超过90％的患者属于鳞癌。浅表性食管鳞状细胞癌是指不管有无淋巴结转移，食管病变局限于粘膜和粘膜下层由于早期缺乏特异性症状，很多病例在确诊时已处于进展期，这导致ESCC的5年总生存率不足20％。但经过内镜治疗的早期食管鳞癌和癌前病变，其五年生存率可达到95％。因此，食管癌的早期诊断和早期治疗对疾病的预后非常重要。目前，胃镜检查和组织病理活检仍然是食管癌筛查和诊断的主要手段。但由于其技术难度大和检查费用高等特点，开展大规模胃镜筛查有很大困难。因此，我们需要一些经济、无创或低创伤性的手段辅助食管癌的诊断和筛查。
[0003]外泌体是直径40
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160nm之间(平均100nm)的细胞外囊泡，可以被人体大多数有核细胞分泌，血液、尿液和精液等各种体液都可以检测到其存在。外泌体几乎包含了所有的细胞成分，如完整的膜结构、蛋白质、脂质以及核酸等。其中，微小(microRNAs，miRNAs)是目前研究最多的一种。miRNAs是长度为20
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22个核苷酸的小型非编码RNA。MiRNAs通过碱基互补配对识别靶基因(messenger RNA,mRNA)的3'UTR区域，并诱导沉默复合物降解mRNA或阻遏靶基因的翻译。在基因表达过程中以负反馈的形式干预遗传物质的表达，从而参与调节细胞周期、分化、发育和代谢等多个环节。在肿瘤患者的血液或肿瘤组织中，可以看到外泌体miRNA表达水平具有明显的差异性。以往的研究表明，ESCC患者的血清外泌体miRNAs在肿瘤的发生发展、预后、放化疗敏感性等方面都发挥着重要作用。但是仍然需要准确的检测方法和检测试剂。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱、检测试剂盒及应用。
[0005]技术方案：本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：
[0006]一种浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱，主要由上调表达的hsa
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miR
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30a
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5p和hsa
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miR
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99a
‑
5p，以及下调表达的hsa
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miR
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185
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5p、hsa
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miR
‑7‑
5p和hsa
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miR
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96
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5p构成。
[0007]进一步的，所述miRNAs来自外周血静脉血的血清。
[0008]本专利技术还提供了所述的浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱的构建方法，包
括以下步骤：
[0009]a)采集浅表性食管鳞癌患者外周血标本，分离纯化外周血清及其中外泌体；
[0010]b)对获得的外泌体进行TEM和NTA鉴定，随后提取外泌体内总RNA分子；
[0011]c)通过质检、建库、第二代高通量测序技术测序及miRNA表达谱鉴定，以健康人血清外泌体miRNA表达谱作为对照，明确浅表性食管鳞癌患者特征性血清miRNAs表达谱；
[0012]d)利用GEO数据库进行在线验证，筛选到的差异miRNAs与血清外泌体差异miRNAs进行韦恩图分析取交集，筛选出共有差异miRNAs表达谱。
[0013]本专利技术还提供了所述浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，包括以下引物：
[0014][0015]本专利技术还提供了所述的逆转录引物和检测引物在制备浅表性食管鳞癌检测试剂或试剂盒中的应用。
[0016]本专利技术最后提供了一种检测浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs的试剂盒，其特征在于，包含所述的逆转录引物和检测引物。
[0017]有益效果：与现有技术相比，本专利技术公开了浅表性食管鳞癌患者血清外泌体miRNAs表达谱，明确了浅表性食管鳞癌患者与健康人群之间差异表达miRNAs分子图谱，从中筛选可作为浅表性食管鳞癌疾病早期诊断、预后评估、疗效预测的生物学标志物；分析了浅表性食管鳞癌细胞特征性miRNAs分子表达图谱；探索了差异miRNA与浅表性食管鳞癌疾病发生进展的相关性及其分子机制。本专利技术的miRNAs表达图谱为多发性浅表性食管鳞癌的治疗提供了理论依据和实验基础。
附图说明
[0018]图1是本专利技术实施例提供的外泌体透射电镜(TEM)图。
[0019]图2是本专利技术实施例提供的外泌体粒径分析(NTA)图。
[0020]图3是本专利技术实施例提供的血清外泌体测序结果的差异表达miRNA热图。
[0021]图4是本专利技术实施例提供的血清外泌体及ESCC组织差异miRNA交集韦恩图。
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐明本专利技术，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求限定的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023]实施例1
[0024]一种浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱模型及其构建方法，具体步骤如下：
[0025]1、样本获取：采集浅表性食管鳞癌患者外周血标本，分离纯化外周血清及其中外泌体并进行鉴定；
[0026]外周血标本采集方法为：用惰性分离促凝管采集空腹静脉血5ml，30min内放入4℃冰箱内保存，所有标本均在当天分离血清。先将样品在4℃，2000转/分钟离心10分钟，之后将上层血清移至EP管中，置于
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80℃冰箱保存以便于后续分析。
[0027]用超速离心法提取血清外泌体，包括如下步骤：
[0028](1)将血清以3000g离心10min去除残留细胞，弃沉淀；
[0029](2)将上清液在10,000g离心30分钟进一步去除细胞碎片，弃沉淀，将上清液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液；
[0030](3)将滤液在110,000g离心90分钟，弃上清；
[0031](4)将沉淀物在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤，并在110,000g再次离心90分钟；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱，其特征在于，主要由上调表达的hsa
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miR
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30a
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5p和hsa
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miR
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99a
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5p，以及下调表达的hsa
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miR
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185
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5p、hsa
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5p和hsa
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5p构成。2.根据权利要求1所述的浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱，其特征在于，所述miRNAs来自外周血静脉血的血清。3.权利要求1所述的浅表性食管鳞癌血清外泌体miRNAs表达谱的构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯亚东，施瑞华，张有玉，姚香怡，
申请(专利权)人：冯亚东，
类型：发明
国别省市：