TaqDNA聚合酶突变体Taq001及其编码基因、表达质粒、原核表达宿主制造技术

本发明专利技术提供了一种Taq DNA聚合酶突变体Taq001，其序列如SEQ ID No.3所示。相较于如SEQ ID NO.1所示的野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列而言，具有V14和G286的氨基酸位点上的替换。还公开了其编码基因、表达质粒和原核表达宿主。在10s/kb的延伸速度下，Taq001的PCR产物产量比野生型Taq DNA聚合酶提高5

【技术实现步骤摘要】
Taq DNA聚合酶突变体Taq001及其编码基因、表达质粒、原核表达宿主


[0001]本专利技术专利涉及一种Taq DNA聚合酶突变体Taq001及其编码基因、表达质粒、原核表达宿主，属于生物工程


技术介绍

[0002]Taq DNA聚合酶属于DNA聚合酶I家族，是目前使用最广泛的热稳定性DNA聚合酶，已成为科研及医疗领域的重要工具。Taq DNA聚合酶包含5
’→3’
核酸外切酶活性结构域，由N端1
‑
291个氨基酸组成，该区域还存在二价金属离子的结合位点。其C端424
‑
832为5
’→3’
聚合酶活性结构域，内部又可分为手掌区域、拇指区域和手指区域，其中手掌区域为 Taq DNA聚合酶的催化中心，拇指区域负责结合引物
‑
模板复合物，并与手指区域一起为三元复合物的稳定以及催化反应的持续提供支持。此外，同源分析结果表明Taq DNA聚合酶的 292
‑
423位氨基酸包含了与3
’→5’
外切酶活性结构域结构类似的序列，但该区域不具备相应活性，导致Taq DNA聚合酶保真性较低。
[0003]一般认为野生型Taq DNA聚合酶的延伸速度约60s/kb，难以满足靶基因快速检测的需求。
[0004]尽管Taq DNA聚合酶早已在体外诊断领域占据了重要地位，但特殊场景的应用还存在许多不足。例如当PCR反应体系中存在0.004％容积率的血液时，野生型Taq DNA聚合酶及截短型Klentaq1 DNA聚合酶引导的扩增均被完全抑制，且Ca2+、Mn2+、K+、Fe3+的存在也会不同程度影响DNA产物的合成。在临床快速检测需求越发紧迫的当下，血液抑制物限制了Taq DNA聚合酶的直接应用，因此而增加的前处理环节不仅减缓了检测的速度，还有可能影响测试的准确性和灵敏度。
[0005]血液中最主要的抑制物包括免疫球蛋白、血铁红素及血红蛋白，其中免疫球蛋白可与单链DNA结合，进而抑制引物退火导致聚合反应无法起始；血铁红素和血红蛋白则可逆地封闭聚合酶的活性位点，使聚合反应提前终止。因而，能耐受上述三种主要抑制物的DNA聚合酶将有希望完成血液直扩，大幅度缩短包括病原体、基因突变的检出时间。
[0006]为了提高Taq DNA聚合酶的性能，一些定向进化的方法被应用于Taq DNA聚合酶的筛选，其中最具优势的是分隔自复制技术。该技术由Ghadessy等人于2001年开发，其主要原理是利用油与水的混合，使水相被分隔为不同的小液滴，水相中包含了PCR反应所需的dNTP、引物、缓冲液等组分，而扩增用的酶和模板则由大肠杆菌提供。通过调整大肠杆菌的投入量，尽可能保证每个液滴内最多存在一个细胞，PCR引物特异性扩增Taq DNA聚合酶的基因片段，实现将酶学活性与DNA序列相关联。通常情况下可利用随机突变等手段，预先构建TaqDNA聚合酶的突变体文库，每个突变体在不同的大肠杆菌中被表达并最终进入不同的水相液滴。只要设置合适的筛选压力，液滴内的PCR反应便能快速地将优势突变体的DNA序列富集。
[0007]分隔自复制技术的筛选通量最高可达到10^8/轮，并且可在数轮内将突变体的种
类降低到 10个以内。该方法自开发至今已成功地应用于提升DNA聚合酶的耐热性、非天然核苷酸的耐受性以及抑制物的耐受性等性能，经过简单改造的类似技术还能实现RNA聚合酶、tRNA 合成酶等非DNA聚合酶的进化。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种筛选出的Taq DNA聚合酶突变体Taq001，能耐受血液抑制物且延伸速度提升。
[0009]本专利技术公开了一种Taq DNA聚合酶突变体Taq001，其序列如SEQ ID No.3所示。相较于如SEQ ID NO.1所示的野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列而言，具有V14和G286的氨基酸位点上的替换。
[0010]本专利技术还公开了上述的Taq DNA聚合酶突变体Taq001的编码基因，其序列如SEQ IDNo.4所示。
[0011]本专利技术还公开了上述的Taq DNA聚合酶突变体Taq001的表达质粒，质粒载体为 pET21b(+)。
[0012]本专利技术还公开了上述的Taq DNA聚合酶突变体Taq001的原核表达宿主，表达宿主为大肠杆菌。
[0013]本专利技术的有益效果如下：在10s/kb的延伸速度下，Taq001的PCR产物产量比野生型TaqDNA聚合酶提高5
‑
20倍，可更快完成低浓度模板的扩增；同时与野生型及截短型(即 Klentaq1)Taq DNA聚合酶相比，Taq001在耐受免疫球蛋白及血红蛋白方面优势显著。
[0014]其中截短型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码基因序列如SEQ IDNO.6所示。
附图说明
[0015]图1为本专利技术测试Taq DNA聚合酶对血液抑制物免疫球蛋白及血红蛋白耐受的琼脂糖凝胶电泳图。免疫球蛋白浓度设置为0到50μg/mL，血红蛋白浓度设置为0到2.5mg/mL。WT 即野生型Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO.1)，Taq001即突变体Taq001(SEQ ID NO.3)，Klentaq1 即截短型Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO.5)。
[0016]图2为本专利技术测试Taq DNA聚合酶对血液抑制物猪血铁红素耐受的琼脂糖凝胶电泳。猪血铁红素浓度设置为0.01到10μM。
[0017]图3为本专利技术测试Taq DNA聚合酶延伸速度的琼脂糖凝胶电泳，仪器设置的延伸速度分别为10s/kb、15s/kb、30s/kb、60s/kb。WT即野生型Taq DNA聚合酶(SEQ ID NO.1)，001 即突变体Taq001(SEQ ID NO.3)。
[0018]图4为本专利技术测试Taq DNA聚合酶PCR产物产量的琼脂糖凝胶电泳。
[0019]图5为对图4的PCR产量的灰度扫描定量结果。
具体实施方式
[0020]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。
[0021]实施例1：
[0022]1、以野生型Taq DNA聚合酶基因序列为模板(如SEQ ID NO.2所示)，在常规PCR体系中引入0.1mM MnCl2提高PCR反应过程的突变率，扩增完成后回收长度约2500bp左右的DNA 条带。
[0023]PCR的引物和反应条件如下：
[0024]Taq*
‑
1:5
’‑
GATATACATATGCGCGGCATGCTGCCGCTGTTCG
‑3’
(SEQ ID NO.7)
[0025]Taq*
‑
2:5
’‑
GGTGGTGCTCGAGTTATTCT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Taq DNA聚合酶突变体Taq001，其特征在于：其序列如SEQ ID No.3所示。2.权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体Taq001的编码基因，其序列如SEQ ID No.4所示。3.权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体Ta...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘想，唐琼卫，安云帆，张增平，商曰朋，刘峰，宋东亮，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：