一种棉花转录因子编码基因GhDOF5.4及获取方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种棉花转录因子编码基因GhDOF5.4及获取方法和应用，GhDOF5.4为SEQ ID N0.1所示的碱基序列；或在SEQ ID N0.1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺失或/和插入的碱基序列变体，且该碱基序列变体所编码的蛋白仍具有GhDOF5.4转录因子的功能或活性。本发明专利技术利用PCR技术，从棉花叶中克隆得到棉花转录因子编码基因GhDOF5.4；然后通过病毒诱导基因沉默(virus

【技术实现步骤摘要】
一种棉花转录因子编码基因GhDOF5.4及获取方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术工程领域，特别是一种棉花转录因子编码基因GhDOF5.4及获取方法和应用。

技术介绍

[0002]植物抗病基因的挖掘主要涉及一些调控基因表达的调控因子，主要包括调控蛋白和转录因子。其中转录因子又称反式作用因子，特异结合到真核基因启动子区域顺式作用元件上，并激活或抑制下游基因的转录。这些转录因子主要包括DOF、WRKY、MYB和NAC等，他们在植物生长发育和防卫反应中发挥着重要的作用。
[0003]棉花属于锦葵科棉属植物，其栽培种目前有4种，包括陆地棉、海岛棉、草棉和亚洲棉，其中陆地棉为主栽品种。棉花是一种重要的经济作物，棉花纤维是纺织工业的重要原料，棉籽油是食品和化工用油的主要来源之一，棉籽粕是牛羊等反刍动物饲料的蛋白添加成分。棉花的产量和品质易受到各种生物胁迫和非生物胁迫的影响，其中棉花黄萎病严重制约着棉花的生产。棉花黄萎病是一种土传性的维管束病害，其病原菌主要为大丽轮枝菌，该真菌属于半知菌亚门轮枝菌属。病原菌从棉花根部入侵，引起植株病变，严重影响着棉花的纤维产量和品质。由于棉花黄萎病分布范围广，危害严重，传播途径多和生存时间长等特点，为解决当前这个棘手的问题，培育抗病品种是最经济有效的方法。然而，棉花抗病品种培育的难点在于抗病种质资源的获得。目前，由于缺乏抗病免疫的种质资源，所以利用常规育种方法很难有效地培育抗病品种。因此，利用基因工程技术挖掘抗病相关基因，创制抗病新品种，成为当前解决棉花黄萎病危害的重要研究方向。总之，提高棉花的抗病性对于棉花的安全生产及人民美好生活具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种棉花转录因子编码基因GhDOF5.4及获取方法和应用。
[0005]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0006]本专利技术的第一个目的是要提供一种棉花转录因子编码基因GhDOF5.4，所述棉花转录因子编码基因GhDOF5.4为SEQ ID N0.1所示的碱基序列；或在SEQ ID N0.1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺失或/和插入的碱基序列变体，且该碱基序列变体所编码的蛋白仍具有GhDOF5.4转录因子的功能或活性。
[0007]进一步地，所述GhDOF5.4转录因子为：
[0008]SEQ ID N0.2所示的蛋白质；
[0009]或将SEQ ID N0.2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GhDOF5.4转录因子功能或活性的蛋白变体。
[0010]本专利技术的第二个目的是要提供一种棉花转录因子编码基因GhDOF5.4的获取方法，包括以下步骤：
[0011]以棉花叶的cDNA为模板，设计引物为DOF5.4
‑
F：5，
‑
ATGCAAGACATCCACTTGATCG
‑
3，；DOF5.4
‑
R：5，
‑
TTACGGTAGATAGAGGGCCG
‑
3，进行PCR扩增，获得大小为993bp的扩增片段即为棉花转录因子编码基因GhDOF5.4。
[0012]本专利技术的第三个目的是要提供一种棉花转录因子编码基因GhDOF5.4在抗黄萎病棉花育种中的应用，具体包括：
[0013]S1、利用PCR扩增GhDOF5.4基因的目的片段，用限制性内切酶BamH I和Kpn I酶切pYL156载体和扩增产物，然后进行连接反应，将片段插入到pYL156载体的BamH I和Kpn I位点之间构建成病毒沉默载体pYL156
‑
DOF5.4；
[0014]S2、将农杆菌GV3101加到含有卡那霉素50mg/mL、庆大霉素50mg/mL和利福平25mg/mL的液体LB培养基中于28℃，200rpm过夜培养，培养液经离心后倒去上清，用10mM MES，10mM MgCl2，200mM AS溶液重悬菌体，调节至终浓度OD600为1.2，放到黑暗处静置2
‑
3小时，然后将含有pYL156
‑
DOF5.4的农杆菌悬浮液与含pYL192的农杆菌悬浮液按1:1混合均匀制成混合菌液，备用；
[0015]S3、当棉花两片子叶完全展开后，先用针头在子叶背面轻轻划出伤口，然后用1mL去掉针头的无菌注射器将混合菌液从子叶背面的伤口处注射进去，使整片子叶全部被侵染，将注射后的植株放到黑暗处处理12h，然后放到光照培养箱进行培养，获得棉花GhDOF5.4基因沉默植株。
[0016]优选地，所述步骤S1中扩增所用引物为VDOF5.4
‑
F：5
’‑
CGGGATCCCCGGAGATTGGGAGTTTTACG
‑3’
；VDOF5.4
‑
R：5
’‑
GGGGTACCTCAGACCTTGACTTTGACTCCAATA
‑3’
。
[0017]与现有技术相比，本专利技术利用PCR技术，从棉花叶中克隆得到棉花转录因子编码基因GhDOF5.4；然后通过病毒诱导基因沉默(virus
‑
induced gene silencing,VIGS)技术获得棉花GhDOF5.4基因沉默植株，对基因沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析，结果显示棉花GhDOF5.4基因沉默植株的抗病性增强，提高了棉花的抗病性能。
附图说明
[0018]图1为GhDOF5.4与拟南芥DOF系统发育树分析对比图。
[0019]图2为棉花受到大丽轮枝菌侵染后GhDOF5.4在不同时间点的表达分析示意图。
[0020]图3为GhDOF5.4基因沉默分析示意图。
[0021]图4为GhDOF5.4基因沉默植株和对照植株发病情况示意图。
[0022]图5为GhDOF5.4基因沉默植株和对照植株发病指数图。
具体实施方式
[0023]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定专利技术。
[0024]以下实施例中有关试剂盒使用参照所购试剂盒的应用说明：
[0025]所用限制性内切酶和其它工具酶分别购自TaKaRa公司和北京全式金生物技术有限公司。
[0026]棉花材料为中棉所35，购自山西农业科学院棉花研究所种苗公司。大肠杆菌
‘
DH5
α
’
感受态细胞和根癌农杆菌菌株
‘
GV3101
’
由植物基因组学国家重点实验室保存。黄萎病菌菌株(大丽轮枝菌，V.dahliae)
‘
V991
’
，由中国农业科学院植物保护研究所简桂良研究员馈赠。各种限制性内切酶及Buffer购本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种棉花转录因子编码基因GhDOF5.4，其特征在于，所述棉花转录因子编码基因GhDOF5.4为SEQ ID N0.1所示的碱基序列；或在SEQ ID N0.1所示的碱基序列基础上进行一个或多个碱基的替换、缺失或/和插入的碱基序列变体，且该碱基序列变体所编码的蛋白仍具有GhDOF5.4转录因子的功能或活性。2.根据权利要求1所述的棉花转录因子编码基因GhDOF5.4，其特征在于，所述GhDOF5.4转录因子为：SEQ ID N0.2所示的蛋白质；或将SEQ ID N0.2所示的蛋白质通过一个或多个氨基酸的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GhDOF5.4转录因子功能或活性的蛋白变体。3.一种如权利要求1所述的棉花转录因子编码基因GhDOF5.4的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：以棉花叶的cDNA为模板，设计引物为DOF5.4
‑
F：5，
‑
ATGCAAGACATCCACTTGATCG
‑
3，；DOF5.4
‑
R：5，
‑
TTACGGTAGATAGAGGGCCG
‑
3，进行PCR扩增，获得大小为993bp的扩增片段即为棉花转录因子编码基因GhDOF5.4。4.一种如权利要求1所述的棉花转录因子编码基因GhDOF5.4在抗黄萎病棉花育种中的应用。5.根据权利要求4所述的棉花转录因子编码基因GhDOF5.4在抗黄萎病棉花育种中的应用，其特征在于，具体包括：S1、利用PCR扩增GhDOF5.4基因的目的片段，用限制性内切酶BamH I和Kpn ...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴家和，胡广，姜辉，权永刚，陈爱民，胡保民，
申请(专利权)人：新疆九中禾棉种有限公司，
类型：发明
国别省市：