检测黄单胞菌的引物、探针、试剂盒及快速检测草莓感染黄单胞菌的方法技术

本发明专利技术属于病菌检测技术领域，公开了一种检测草莓黄单胞菌的引物，所述引物对的正向引物序列为：所述引物对的正向引物序列为：5

【技术实现步骤摘要】
检测黄单胞菌的引物、探针、试剂盒及快速检测草莓感染黄单胞菌的方法


[0001]本专利技术属于病菌检测
，涉及一种检测草莓黄单胞菌的引物、探针、试剂盒及快速检测草莓感染黄单胞菌的方法。

技术介绍

[0002]草莓(Fragaria
×
ananassa)是一种重要的经济水果。随着草莓种植的迅速发展和栽培模式的多样化，草莓病害的种类和发生率不断增加严重影响草莓品质并导致经济损失。在草莓上常见的病原菌分为真菌、细菌、病毒三大类，其中细菌中的黄单胞菌对草莓产业具有严重破坏性。
[0003]草莓黄单胞菌是一种生长缓慢的革兰氏阴性细菌，但草莓黄单胞菌的致病力很强，可以在草莓上低密度存活，易导致叶片角斑、茎腐，但在染病植株在初期不表现任何症状，随时间推移受感染的植株在叶表面上形成小的水浸病变，扩大并变成红色甚至坏死的病斑，严重时短缩茎部位感染出现空洞导致植物活力下降、倒伏和整个植物死亡，从而造成草莓产量大幅损失，引起巨大的经济损失。因该病原菌的特殊性，如果不在病害发生的初期采取合理防治措施，会导致草莓发病后损失巨大。所以有必要对草莓黄单胞菌进行早期快速、准确、灵敏地检测避免移栽后大面积的发生病害。
[0004]近年来早期检测技术发展迅速，已从传统的目视检查、抗体检测发展到目前的分子检测，主要是聚合酶链反应(PCR)，该方法具有很高的特异性与灵敏度，也是目前针对草莓主要病害检测的最主要、应用最广泛的技术。为进一步提高检测效率和灵敏度在常规PCR的基础上发展了实时荧光PCR、巢式PCR等，但这些技术均具有一定的缺陷，需要配置昂贵设备以及较高专业技术的人员进行操作，并且方法步骤复杂导致消耗时间长，限制了其在病原菌快速检测中的应用。因此，研发更快速、易操作、可视化的现场检测的方法对于草莓病害的预防至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供检测草莓黄单胞菌的RPA引物对、探针及试剂盒，可以在30min内完成样品的现场检测，检测时间短，检测成本低，且不需要专业人员就能操作，可在基层进行大规模推广。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种检测草莓黄单胞菌的RPA引物对，所述引物对的正向引物序列为：5
′‑
GTATGTGAATTTCCGGTCATTCTGCCCACT
‑3′
；反向引物序列为：5
′‑
CACTTGCCGACAACACCTTTGCCATAGAG
‑3′
。
[0007]本专利技术提供一种检测草莓黄单胞菌的RPA探针，所述探针序列：5
′‑
GATTCTGAGCAATGCGTTGCTGACAGGCCGTAAAAGATTTGATGGT
‑3′
。
[0008]本专利技术提供一种检测草莓黄单胞菌的RPA试剂盒，所述试剂盒包括上述RPA引物
对、上述RPA探针、以冻干粉形式存在的RPA反应组分和RPA反应缓冲液。
[0009]本专利技术还提供利用上述试剂盒快速检测草莓感染黄单胞菌的方法，包括以下步骤：用核酸释放剂处理待测样品5min作为RPA反应核酸模板，利用试剂盒、模板配制RPA反应体系，在37℃
‑
39℃恒温扩增8
‑
10min，取10μL扩增产物用ddH2O稀释到200μL，取50μL滴入胶体金试纸条的点样孔中进行检测，2min后观察试纸条结果，若出现C线和T线两个红色条带或者一条T线红色条带表明待测样品为阳性，若出现一条C线红色条带则表明待测样品为阴性。
[0010]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术侧层流析
‑
重组酶聚合酶扩增技术(LF
‑
RPA)方法中引物特异性较好，不与其他真菌、细菌发生交叉反应。
[0011]本专利技术侧层流析
‑
重组酶聚合酶扩增技术(LF
‑
RPA)方法可以在30min内完成样品的检测，检测时间短、时效性更好，相比对《草莓角斑病菌检疫鉴定方法》GB/T 29429
‑
2012，大大减少了检测周期，可以实现在苗木交易过程中完成检测，减少农户受损。
[0012]本专利技术侧层流析
‑
重组酶聚合酶扩增技术(LF
‑
RPA)方法在体温或自然温度(35℃
‑
37℃)进行扩增，结果检测也在常温下进行，不需要在室内昂贵的仪器中进行，单次检测费用不足100元，相比于《草莓角斑病菌检疫鉴定方法》GB/T 29429
‑
2012，大大节省了降低了检测成本。
[0013]本专利技术侧层流析
‑
重组酶聚合酶扩增技术(LF
‑
RPA)方法，流程简单，操作步骤较少，不需要专业人员，基层技术人员完全可以独立完成检测任务，相比于《草莓角斑病菌检疫鉴定方法》GB/T 29429
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2012，大大降低了技术要求。
[0014]本专利技术侧层流析
‑
重组酶聚合酶扩增技术(LF
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RPA)方法，通过现场采样处理完成检测，不经过病原菌纯化、培养、回接等过程，不存在病原菌传播扩散的风险，生物安全友好。
[0015]本专利技术侧层流析
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重组酶聚合酶扩增技术(LF
‑
RPA)方法可采用试剂盒方式实现基层大规模推广，不存在产能或者检测条件不足的问题，可实现大规模推广。
附图说明
[0016]图1为本专利技术设计的7对RPA引物扩增凝胶电泳结果。
[0017]图2为本专利技术目的基因全长PCR扩增凝胶电泳结果。
[0018]图3为本专利技术RPA引物对草莓黄单胞菌目的基因重组质粒不同浓度梯度进行RPA扩增试纸条检测结果。
[0019]图4为本专利技术PCR引物对草莓黄单胞菌目的基因重组质粒不同浓度梯度进行PCR扩增结果。
[0020]图5为本专利技术感染其他主要草莓病原菌的草莓样品根际和土壤提取的总核酸进行RPA扩增检测结果。
[0021]图6为本专利技术26种草莓根际真菌和细菌的RPA扩增结果。
具体实施方式
[0022]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限定本专利技术的保护范围。若未特别指明，实
施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0023]实施例一1、病原菌来源及培养收集河南省郑州市管城区中国农业科学院郑州果树研究所草莓基地由黄单胞菌引起症状的草莓植株并从根茎中分离病原菌。用75％的酒精消毒15s，2％的次氯酸钠消毒5mins，并用无菌水冲洗数次，然后在灭菌的滤纸上将病变部位切成小块放置在SPA培养基上，在37℃培养箱倒置培养3
‑
5天直到长出圆形，略微凸起，粘稠的黄色菌落作为候选者，经16s rDNA测序鉴定确定后继续培养。所有分离的病原菌均以以上方法进行分离，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测草莓黄单胞菌的RPA引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物序列为：5
′‑
GTATGTGAATTTCCGGTCATTCTGCCCACT
‑3′
；反向引物序列为：5
′‑
CACTTGCCGACAACACCTTTGCCATAGAG
‑3′
。2.检测草莓黄单胞菌的RPA探针，其特征在于，所述探针序列：5
′‑
GATTCTGAGCAATGCGTTGCTGACAGGCCGTAAAAGATTTGATGGT
‑3′
。3.检测草莓黄单胞菌的RPA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，史春佳，赵霞，刘丽锋，宋艳红，周厚成，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：