用于表征药物产品杂质的系统和方法技术方案

提供了用于表征低分子量(LMW)蛋白质药物产品杂质的系统和方法。一个实施方案使用结合质谱分析的亲水相互作用色谱法(HILIC)。在从所述蛋白质药物产品，例如抗体药物产品中除去N

【技术实现步骤摘要】
用于表征药物产品杂质的系统和方法
[0001]本申请是申请号为201880080694.0、申请日为2018年12月18日、专利技术名称为“用于表征药物产品杂质的系统和方法”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2018/066160的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2017年12月22日、申请号为62/610,029的美国申请，以及申请日为2018年10月10日、申请号为62/743,632的美国申请的优先权。


[0002]本专利技术总体上涉及蛋白质分离方法和细胞培养方法。
[0003]专利技术背景
[0004]在过去的二十年中，单克隆抗体(mAb)已成功地用于靶向广泛范围的治疗领域(Walsh G.,Nature biotechnology,32:992
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1000(2014)；Lawrence S.Nature biotechnology,25:380
‑
2(2007))。尽管mAb具有由两个二硫键连接的重链组成的保守共价异四聚体结构，每个重链通过二硫键与轻链共价连接，但是即使在大量纯化步骤之后，这些蛋白质也通常含有低水平的产品相关的杂质。低分子量(LMW)种类(例如肽主链截短的片段)和高分子量(HMW)种类(例如抗体二聚体种类)两者均是产品相关的杂质的实例，所述杂质导致mAb产物的大小异质性。由于蛋白质聚集而在治疗性mAb药物产品中形成HMW种类可能潜在地损害药物功效和安全性(例如引发不想要的免疫原性应答)(Rosenberg AS.The AAPS journal,8:E501
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7(2006)；Moussa EM,等人Journal of pharmaceutical sciences,105:417
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30(2006))。任何治疗性蛋白质的LMW种类都可能由产生过程中的宿主细胞蛋白酶活性引起。相对于抗体的单体形式，LMW种类通常具有低活性或实质上降低的活性，同时暴露可在体内导致免疫原性或潜在影响药代动力学性质的新表位(Vlasak J,Ionescu R.mAbs,3:253
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63(2011))。因此，HMW种类和LMW种类两者均被视为关键质量属性，在药物开发过程中并在制造过程中作为纯化药物物质的释放测试的一部分定期监测所述关键质量属性。
[0005]传统上，mAb产物的分子量异质性通过多种正交分析方法来表征(Michels DA,Parker M,Salas
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Solano O.Electrophoresis,33:815
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26(2012))。用于评估mAb产物纯度的最常用技术之一是在非还原条件下进行的SDS
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PAGE。关于抗体，在分析过程中，可常规地观察并定量对应于LMW种类的次要条带，包括H2L(2条重链和1条轻链)、H2(2条重链)、HL(1条重链和1条轻链)HC(1条重链)抗体)以及LC(1条轻链)种类(Liu H,Gaza
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Bulseco G,Chumsae C,Newby
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Kew A.Biotechnology letters,29:1611
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22(2007))。还可观察到蛋白水解片段。可通过经由埃德曼(Edman)降解的N
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末端测序、凝胶内胰蛋白酶消化、随后质谱分析以及使用抗Fc和抗轻链抗体的蛋白质印迹分析来支持每个次要条带的所提出的身份。然而，从这些方法得到的任何提出的结构都不能在完整蛋白水平下得到明确证实。此外，在SDS
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PAGE实验中使用的样品制备条件可通过二硫键混杂产生LMW伪影，这可导致对次要LMW种类的过高估计(Zhu ZC,等人Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,83:89
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95(2013))。最近，毛细管电泳
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十二烷基硫酸钠(CE
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SDS)已成为SDS
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PAGE的现代等
效物，提供优异的可再现性、灵敏度和通量(Rustandi RR,Washabaugh MW,Wang Y.Electrophoresis,29:3612
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20(2008)；Lacher NA,等人Journal of separation science,33:218
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27(2010)；Hunt G,Moorhouse KG,Chen AB.Journal of chromatography A,744:295
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301(1996))。在mAb产物的CE
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SDS分析过程中，可常规地观察到具有比完整抗体更短的迁移时间的次要峰(LMW形式)。与SDS
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PAGE分析不同，这些LMW杂质不能提取或进行进一步分析。结果，通常仅基于经验知识提出在CE
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SDS方法中观察到的LMW杂质的身份。因此，直接分离并明确鉴定mAb产物中的LMW杂质的正交方法对于确保在抗体产品研发过程中控制制造过程至关重要。
[0006]作为最可靠的鉴定技术之一，通过现代质谱仪对完整mAb蛋白进行精确的质量测量已在生物制药行业中日渐流行(Kaltashov IA,等人,Journal of the American Society for Mass Spectrometry,21:323
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37(2010))；Zhang H,Cui W,Gross ML.FEBS letters,588:308
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17(2014))。具体而言，各种“联用色谱
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质谱”方法已证明了检测mAb产物中的低丰度杂质并提供通过SDS
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PAGE或CE
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SDS方法不能实现的高度详细的分析的能力(Le JC,Bondarenko PV.Journal of the American Society for Mass Spectrometry,16:307
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11(2005)；Haberger M,等人mAbs,8:331
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9(2016))。例如，反相色谱法(RPLC)与质谱法结合可用于检测mAb药物产品中存在的游离轻链和相关的翻译后修饰(例如，半胱胺酰化和谷胱甘肽化)。但是，与SDS
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PAGE和CE
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SDS方法相比，RPLC通常缺乏足够的分辨率来分离LMW种类，并且因此无法阐明完整LMW谱。例如，基于RPLC的完整质量分析从未报告过mAb药物产品中的H2L种类的鉴定，这是由于H2L种类的低丰度和与主要完整抗体的较差分辨。另一种对于表征mAb产物相关的杂质的基于MS的技术是天然电喷雾电离质谱(天然ESI
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MS)，所述技术当与尺寸排阻色谱法(SEC)结合时特别有用(Hab本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于表征低分子量蛋白质药物产品杂质的方法，所述方法包括：i)使蛋白质药物产品样品去糖基化，其中所述蛋白质药物产品选自抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合；ii)通过亲水相互作用色谱法分离所述蛋白质药物产品样品的蛋白质组分；以及iii)通过质谱法分析所述分离的蛋白质组分以表征所述蛋白质药物产品样品中的低分子量蛋白质药物产品杂质，其中所述低分子量蛋白质药物产品杂质选自游离轻链、半抗体、H2L、H2、HL、HC或它们的组合，并且包含介于0.05％至30.0％(w/w)之间的低分子量蛋白质药物杂质。2.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质药物产品样品来自补料分批培养物。3.如权利要求1或2所述的方法，其中通过亲水相互作用色谱法分离所述蛋白质药物产品样品的蛋白质组分包括从所述蛋白质药物产品中除去N
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连接的聚糖。4.如权利要求1或2所述的方法，其中通过亲水相互作用色谱法分离所述蛋白质药物产品样品的蛋白质组分在变性条件下进行。5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括还原所述蛋白质药物产品样品的步骤。6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质药物产品是重组IgG1 mAb(mAb
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1)抗体。7.一种通过权利要求1或2所述的方法产生的蛋白质药物产品，其包含介于0.05％至30.0％(w/w)之间的低分子量蛋白质药物杂质。8.如权利要求7所述的蛋白质药物产品，其中所述药物产品包含介于0.05％至25％w/w之间的低分子量蛋白质药物杂质。9.如权利要求7所述的蛋白质药物产品，其中所述药物产品包含介于0.05％至15％w/w之间的低分子量蛋白质药物杂质。10.如权利要求6
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9中任一项所述的蛋白质药物产品，其中所述药物产品包含：(a)介于0.05％至10％w/w之间的低分子量蛋白质药物杂质；或者(b)介于0.05％至5％w/w之间的低分子量蛋白质药物杂质。11.一种用于表征低分子量药物杂质的系统，其包括：亲水相互作用液相色谱系统，所述亲水相互作用液相色谱系统包括连接至至少两个流动相柱的亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱，其中所述HILIC柱与质谱系统处于流体连通，其中所述HILIC柱用于分离蛋白质药物产品样品的蛋白质组分，所述蛋白质药物产品选自抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合，并且所述质谱系统用于分析所述蛋白质药物产品样品中的低分子量蛋白质药物产品杂质，并且所述低分子量蛋白质药物产品杂质选自游离轻链、半抗体、H2L、H2、HL、HC或它们的组合，并且包含介于0.05％至30.0％(w...

【专利技术属性】
技术研发人员：王顺海，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：